GCSF动员对供者T淋巴细胞亚群功能和急性移植物抗宿主病的影响

1、G-CSF发动对供者T淋巴细胞亚群成效和急性移植物抗宿主病的影响刘庆国，杨栋林，黄勇，姜尔烈，周世勇，何依，王志东，王玫【摘要】为了研究粒细胞集落刺激因子G-SF发动对供者T淋巴细胞亚群成效和急性移植物抗宿主病aGVHD的影响，对20例供者G-SF发动前后的外周血样品，参加佛波醇酯、伊能霉素、莫能霉素体外刺激造就4小时，以3色荧光标识表记标帜法流式细胞术检测T细胞亚群排泄INF-、INF-、型排泄IL-4、IL-5和IL-10细胞比例。效果表白：G-SF发动前外周血D3+IFN-+、D4+IFN-+和D8+IFN-+T细胞的比例别离为3.2%(0%-45.9%)、1.3%(0%-23.8%)和

2、1.5%(0%-22.2%)，G-SF发动后前述细胞比例明显升高，别离为19.2%(0%-53.9%)、9.5%(0%-49.5%)和7.5%(0%-38.1%)。发动前D3+IL-2+、D4+IL-2+、D8+IL-2+T细胞比例别离为1.5%(0%-31%)、0.8%(0%-30.0%)和0%(0%-5.3%)，发动后比例亦显着升高，别离为25.7%(0%-51%)、19.8%(0%-39.7%)、4.6%(0%-20.9%)。T细胞各亚群的IL-4阳性细胞比例在发动后升高不显着。移植早期aGVHD产生组供者的T1细胞比例明显高于无aGVHD组。发动后高T2比例组，其受者中、重度aGVHD

3、的产生率显着低于低T2比例组别离为20.0%和77.8%。结论：G-SF发动使供者外周血的I型T细胞比例增长，发动后高T1细胞比例与移植早期aGVHD产生相干，T2比例与中重度aGVHD产生率负相干。【关键词】G-SF发动；T淋巴细胞亚群；移植物抗宿主病InfluenefG-SFbilizatinnFuntinsfDnrTLyphyteSubppulatinandAuteGraft-versus-HstDiseaseKeyrdsG-SFbilizatin；Tlyphytesubppulatin；autegraft-versus-hst-disease急性移植物抗宿主病aGVHD是异基因造血干细

4、胞移植(all-HST)的常见并发症，aGVHD的产生率高达30%-80%，产生aGVHD者因直接和间接缘故原由而殒命的产生率可达50%1。aGVHD重要由T细胞介导，这个病理历程起始于移植物中供者T细胞与受者抗原相遇，随后供者T细胞识别受者抗原产生克隆性扩增，其不但直接通过细胞毒作用对构造细胞举行打击，并通过排泄细胞因子间接造成构造损伤。按照细胞因子的产生，T淋巴细胞被分类为型和型T细胞。排泄IFN-、TNF-的D4+T细胞Th1和D8+T细胞T1被以为是型T细胞，其在免疫应答历程中诱导细胞介导的免疫和迟发型免疫反响，在抗病毒和扫除细胞内抗原方面发挥作用。排泄IL-4、IL-5和IL-10的

5、D4+T细胞Th2和D8+T细胞T2被以为是型T细胞，其重要通过促使B淋巴细胞产生IgE和召募嗜酸、嗜碱粒细胞诱导过敏反响，在扫除细胞外抗原方面发挥作用2。T细胞群的细胞因子谱可因刺激和所处微情况差异而转换为型或型免疫应答。在人类和小鼠的免疫体系中，型细胞因子能按捺T细胞增殖和Th1细胞因子的产生。由Th2排泄的IL-4具有按捺T1合成IL-2的作用，并能下调I型细胞的因子合成、细胞增殖和恒久细胞毒性。固然T1和T2细胞都具有细胞毒作用，但T2的细胞毒作用相对较弱。与T1排泄高程度IFN-并促进Th1细胞发育相反，T2排泄IL-4不但对Th2细胞起促进作用并能按捺Th1细胞发育。因此，型和型T

6、细胞彼此调治，两者之间的平衡决定着细胞免疫和炎症反响的特性。在造血干细胞移植中，绝大多数受者的aGVHD产生于T细胞免疫重修后，而由于放、化疗预处置惩罚及皮质激素应用导致了胸腺成效非常3，T细胞免疫重修有赖于移植物中成熟T细胞扩增4。因此，供者T细胞的免疫成效特性影响着受者移植后免疫。异基因外周血干细胞移植all-PBST的移植物中含有比骨髓移植物高10-20倍的T细胞，但aGVHD的产生率和严峻度并无显着增长，而慢性移植物抗宿主病GVHD的产生率明显增高，提示供者T细胞成效在G-SF发动后具有奇特的特性。在本研究中，我们应用佛波醇酯PA+伊能霉素inyin)和莫能霉素(nensin)刺激造就

7、G-SF发动前、后供者外周血标本，用流式细胞术检测T细胞亚群的、型细胞比例的变革，探究供者T细胞亚群、型细胞的比例与aGVHD的相干性，以期有助于相识aGVHD的产生气制。质料和要领病例标本取自2002年11月至2022年7月间在我院举行all-PBST的20例患者。供者中位年事46岁21-63岁，此中女13例，男7例；受者中位年事31岁14-46岁，此中女4例，男16例。患者疾病范例包罗急性淋巴细胞白血病5例第1次完全缓解期2例，第2次完全缓解期2例，部门缓解1例，急性粒细胞白血病第1次完全缓解期4例，慢性粒细胞白血病10例慢性期7例，加快期2例，急性变1例，重型再生停滞性血虚1例。供者外周

8、血干细胞发动接纳惠尔血日本麒麟公司5g/kg皮下注射，1日2次，于第5和第6天网罗干细胞。患者预处置惩罚接纳单次满身照耀TBI7Gy环磷酰胺Y60g/kg2天阿糖胞苷1g/2，12小时1次2天方案，大概马利兰BU4g/(kgd4天Y60g/kg2天方案。aGVHD防范接纳FK5060.03g/kg，大概FK506抗D25单克隆抗体TX联用。aGVHD的诊断尺度按照文献5。重要试剂D8-PerPSK2克隆、PerP-istypeX40克隆、IL-2PE5344.111克隆购自BetnDikinsn公司，IL-4-PE4S.B3克隆、IFN-PE4S.B3克隆、PE-istypeuseIgG1以及

9、D3-FITSK7克隆购自BetnDikinsn-法默金公司。溶血素BDFASLysingSlutin)、破膜剂BDFASPereabilizingSlutin2均购自BetnDikinsn公司。PA、伊能霉素(inyin)、莫能霉素(nensin)购自Siga公司。ID造就基、胎牛血清等购自GibBRL公司。标本接纳用肝素抗凝管别离在供者外周血干细胞发动前、发动后网络外周血1l。细胞造就肝素抗凝全血1l与ID11在造就皿中混匀，并参加佛波醇酯(10ng/l)和伊能霉素(500ng/l)、莫能霉素(1.7g/l)，37、52孵箱中孵育4小时。细胞外貌染色及胞内染色将20lD3-FIT和D8-P

10、erP别离参加Faln管中。将造就4小时后的稀释全血200l别离参加上述各Faln管，涡旋混匀，室温避光孵育15分钟。15分钟后，各管中参加2-3l1FAS溶血素混匀，室温避光孵育10分钟后500g离心5分钟，弃上清。别离参加1破膜剂(BDPereria2)500l涡旋混匀，室温避光孵育10分钟。完毕后参加2-3l洗液含2热灭活胎牛血清和0.1%叠氮钠的PBS，离心500g5分钟后弃上清。在比拟管中参加PE-istype，检测管中别离参加IL-4-PE、IFN-PE，室温避光孵育30分钟。用洗液洗1遍，弃上清，以1多聚甲醛悬浮细胞至500l待测。流式细胞术检测阐发样本在FASalibur流式细

11、胞仪上举行检测，应用ellQuest软件举行测定和阐发。起首在前向散射光FS对侧向散射光SS的点图内设门gating，淋巴细胞群作为门1G1，门内网络10000淋巴细胞。以G1为底子在D3和SS的点图内圈定D3+淋巴细胞群作为门2G2。阐发G1内D3+细胞群的细胞因子IL-4、IFN-、IL-2阳性细胞比例，并阐发G2内D3+细胞群中D8+和D8-细胞的细胞因子表达细胞比例，以IFN-阳性和IL-4阳性别离代表、型T细胞。统计阐发应用SPSS10.0软件举行统计学阐发。检测效果以中位数最小值-最大值表现。发动前后比力接纳配对样本t查验，组间比力接纳非参数查验以及卡方查验。效果供者型、型T淋巴细

12、胞亚群细胞比例在发动前后的变革检测20例供者发动前后T淋巴细胞亚群的INF-和IL-4阳性细胞比例，并举行发动前后比力。效果表现，供者INF-阳性D3+、D4+、D8+T细胞的比例在G-SF发动后明显升高，而IL-4阳性D3+、D4+、D8+T细胞比例升高不明显。检测了14例供者IL-2阳性T淋巴细胞亚群比例，各亚群的IL-2阳性细胞比例在发动后均显着升高附表。Table.hangesfdnrstypeandratisfTlyphytesubppulatinellsbefreandafterbilizatin略G-SF发动对差异HLA等位基因供者的影响11例供者表达HLA等位基因A1、A3、A

13、24、B44、B60、DR15、DR17阳性基因。这些供者发动后的D3+IFN-+T细胞比例为33.8%(0.3%-53.9%)，显着高于发动前的比例3.5%(0%-45.9%)P=0.01。未表达前述HLA等位基因阴性基因的9例供者发动后D3+IFN-+T细胞比例14.0%(0%-38.6%)与发动前比例2.7%(0%-28.5%)比拟无显着差异P=0.137图1。aGVHD组和无aGVHD组的供者T淋巴细胞亚群、型细胞比例比力去除移植后早期殒命的1例患者，有12例患者在移植后1月内产生aGVHD，与另7例无aGVHD者比拟，两组供者的T淋巴细胞亚群、型细胞比例与发动前无显着差异，而发动后a

14、GVHD组的T1细胞比例明显升高，T1在aGVHD组和无aGVHD组的比例别离为10.2%(0.3%-38.1%)vs1.1%(0.0%-16.0%)(P=0.042)图2。高T2细胞比例与中重度aGVHD的相干性以上述19例供者发动后中位T2比例值1.9%为界，T2比例1.9%者有10例，1.9%者有9例，移植后前者仅有2例产生中重度aGVHD20.0%，此后者有7例(77.8%)产生中重度aGVHD(P=0.019)，效果呈负相干。讨论早期研究创造，G-SF能加强效应细胞抗体依靠的细胞毒效应6。应用RT-PR要领研究创造，G-SF发动后癌症患者外周血单个核细胞(G-PBN)连续高表达IL-

15、2、4、10、IFN-和TNF-7。比年来的研究表现，与正凡人的PBN比拟，从G-SF发动后癌症患者PBN中纯化的D4+、D8+T细胞的IL-2、4、10和IFN-的RNA程度增长8。本研究应用流式细胞术检测淋巴细胞内细胞因子卵白程度表达，创造G-SF发动后IL-2、IFN-阳性细胞比例明显增长，与发动前比拟，发动后IL-4阳性细胞比例虽有增长但差异不明显。G-SF对淋巴细胞发挥作用简直切机制如今尚不明晰。早期不雅点以为，淋巴细胞没有G-SF受体，因此推测大概是通过间接调治机制发挥作用。Sland等9用RT-PR要领在G-SF刺激造就后的纯化淋巴细胞中创造G-SF受体RNA表达，提示G-SF大

16、概直接作用于淋巴细胞，但是其确切作用机制至今尚未明白阐述。别的，在Jshi等10的研究中，发动后供者T细胞免疫成效加强大概削弱与自身的HLA等位基因有关，携带HLA-A1、A3、A24、B44、B60、DR15、DR17等位基因的供者，发动后T细胞排泄I型细胞因子TNF-和IL-1的本领加强。其研究与如今以为HLA相条约胞移植中HLA-A3等位基因与高aGVHD伤害相干的不雅点部门符合11。本研究创造，表达前述HLA等位基因的供者在发动后IFN-阳性T细胞比例亦显着增长，因此G-SF发动后细胞免疫成效加强的机制较为庞大，有待于进一步研究。G-SF发动后淋巴细胞免疫成效加强，但临床上并未创造外周

17、血干细胞移植比骨髓移植有更高的aGVHD产生率。研究创造，G-SF发动后的干细胞网罗物G-PBS中含有比尺度骨髓网罗物中高约50倍以上的单核细胞及其祖细胞12，发动后的单核细胞产生型极化，从而按捺T细胞的成效。别的，新近研究创造，G-PBS中含有较多的低密度粒细胞LDG，其能按捺T细胞产生IFN-和IL-4的成效，而去除LDG后T细胞产生细胞因子的本领又会规复13。因此，G-PBS中高比例单核细胞、LDG对T淋巴细胞成效的按捺大概是all-PBST的aGVHD产生率不高于BT的缘故原由。比力移植早期产生aGVHD组与无aGVHD组，aGVHD组的供者发动后T1D8+IFN-+细胞比例明显升高。T1细胞不但以细胞-细胞方法通过诱导穿孔素、端粒酶和Fas依靠的细胞毒作用直接导致靶