JJF(黔) 60-2021 荧光定量聚合酶联反应分析仪校准规范

1、 贵州省地方计量技术规范JJF（黔）60-2021荧光定量聚合酶链反应分析仪校准规范Calibration Specification of Fluorescent Quantitative PolymeraseChain Reaction AnalyzerXXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施 JJF（黔）XX2021荧光定量聚合酶链反应JJF(黔)602021分析仪校准规范Calibration Specification of FluorescentQuantitative Polymerase Chain Reaction Analyzer JJF（黔）XX2021 JJF（

2、黔）XX2021目 录引言.（II）1范围.（1）2引用文件.（1）3术语和定义.（1）4概述.（2）5计量特性.（3）6校准条件.（3）6.16.2环境条件 .（3）测量标准及其他设备 .（4）7校准项目和校准方法.（4）7.17.2校准项目 .（4）校准方法 .（4）8校准结果表达与处理.（10）8.1校准记录.（10）8.2校准结果的处理.（10）9复校时间间隔.（11）附录A校准记录格式.（12）附录B校准证书内页格式.（15）附录C温度示值误差和Ct值示值误差的测量不确定度评定示例.（16）I JJF（黔）XX2021引 言本规范依据JJF1071-2010国家计量校准规范编写规则和

3、JJF1001-2011通用计量术语及定义、JJF 1059.1-2012测量不确定度评定与表示编制。其计量特性和校准方法参照了JJF1527-2015聚合酶链反应分析仪校准规范、YY/T1173-2010聚合酶链反应分析仪、SN/T2102.2-2008/ISO/TS20836:2005食源性病原体PCR检测技术规范.第2部分：PCR仪性能试验要求。II JJF（黔）XX2021荧光定量聚合酶链反应分析仪校准规范12范围本规范适用于荧光定量聚合酶链反应分析仪的校准。引用文件本规范引用了下列文件：JJF 1527-2015聚合酶链反应分析仪校准规范YY/T 1173-2010聚合酶链反应分析仪

4、SN/T 2102.2-2008/ISO/TS 20836:2005食源性病原体 PCR检测技术规范.第2部分：PCR仪性能试验要求凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本规范；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本规范。3术语3.1聚合酶链反应 polymerase chain reaction，PCR一种对特定的DNA或RNA片段在体外进行快速扩增的方法，由变性退火延伸三个基本反应步骤构成。3.2温度最大过冲量 temperature maximum shoot仪器均热快温度升高或降低至设定值过程中，所有采样孔温度超出设定温度值的最大幅度。3.3荧光染料 flu

5、orochrome由短波长激发光激发，释放出可见光的试剂。注：常见的荧光染料有FAM、HEX、Texas Red、VIC、Cy3、ROX等。3.4荧光强度检测精密度 precision of fluorescence intensity对多个检测孔在同一荧光条件下重复荧光强度测量，其测量值的一致性。3.5阈值循环数Ct (Cp) cycle threshold cycle, crossing point实时监测扩增过程中，反应管内的荧光信号到达指数扩增时经历的循环周期数。主要的计算方式是以扩增过程前315个循环的荧光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值时的循环数则为阈值循环数（Ct），简称

6、Ct值。1 JJF（黔）XX20213.6 Ct值精密度 precision of threshold cycle对多个测量孔在同一荧光条件下重复Ct值测量，其测量值的一致性。3.7熔解温度 melt temperature总的DNA双螺旋结构降解一半时的温度，简称 值，不同序列的DNA，不同。值3.8熔解温度漂移 melt temperature bias同一熔解温度在不同通道发生漂移形成多峰的现象，熔解温度值与光学标准器熔解温度设定值之差。3.9熔解曲线 melt curvePCR扩增反应过程中，均热快采样孔的荧光强度与温度形成的曲线。3.10峰值高度 peak heights熔解曲线上扩

7、增产物的熔解温度对应特征峰的高度。3.11通道峰值高度一致性 channel peak height consistency不同采样孔在同一熔解温度对应峰值高度的一致性。3.12线性灵敏系数 linear sensitivity factor表征熔解曲线线性变化灵敏程度具体化参数。4概述荧光定量聚合酶链反应分析仪（ fluorescent quantitative polymerasechain reaction analyzer，以下简称荧光定量PCR仪）为在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的仪器。荧光定量PCR分析

8、仪主要通过仪器内部热循系统的升降温变化，使得脱氧核糖核酸（ Deoxyribonucleic Acid，DNA）或核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）片段得以复制扩增，仪器光学系统采集伴随 DNA或RNA扩增产生的荧光信号，并对荧光信号进行分析转化、数学运算后，得到扩增和熔解曲线。通常荧光定量PCR仪由温度控制系统、光学系统和控制系统组成，常见的荧光定量PCR仪有32孔、48孔、96孔等，其中 96孔使用最广泛。荧光定量 PCR仪检测原理图见图1。2 JJF（黔）XX2021图1荧光定量PCR仪检测原理图5计量特性荧光定量PCR仪计量特性见表1。表1荧光定量PCR仪计量特性项目

9、指标0.51.03.01.51.52.55温度示值误差/设定温度点/：温度均匀度/30、50、60、70、90、95温度参数温度最大过冲量/平均升温速率/(/s)平均降温速率/(/s)Ct值示值误差升温范围：5090降温范围：9050Ct值均匀度光学系统物理 Ct值精密度/%10方法参数通道峰值高度一致性0.20.21线性灵敏系数熔解温度漂移/荧光强度精密度/%样本精密度/%5光学系统生物化学方法参数3荧光线性相关系数样本线性相关系数0.9900.9806校准条件6.1环境条件6.1.1环境温度：（1530）。3 JJF（黔）XX20216.1.2相对湿度：（2085）%。6.1.3应远离振动

10、、电磁干扰。6.2测量标准及其他设备6.2.1温度标准器测温范围为（0120），最大允许误差为0.1。6.2.2光学标准器波长范围为（380780）nm，相对光辐射强度为（10100）%。6.2.3标准物质校准时应采用有证标准物质，包括质粒DNA标准物质、核糖核酸标准物质，其特性量值（拷贝数10copies/L，相对扩展不确定度5%）。96.2.4移液器规格：2L、10L、100L、200L、1000L，需通过计量检定/校准。7校准项目和校准方法7.1校准项目温度控制系统校准项目为温度参数校准，光学系统校准项目可选择物理方法参数校准或生物化学方法参数校准。7.2校准方法7.2.1校准前准备开机

11、预热30 min，将被校仪器与温度标准器和光学标准器各部件连接完好。在精密温度传感器表面上涂抹适量导热油，并确保与加热模块接触良好。温度和光学标准器分布于均热模块采样孔中，96孔荧光定量PCR仪标准器位置分布示意图见图2，其他孔数的荧光定量PCR仪参照图2放置标准器。a）7个标准器位置分布b）15个标准器位置分布图2 96孔荧光定量PCR仪标准器位置分布示意图4 JJF（黔）XX20217.2.2设置校准程序参照被校荧光定量PCR仪说明书设定控制程序，校准控制程序见表2，不能设定30为程序起点的荧光定量PCR仪，参照表2进行设定。整个校准程序包括预热、温度控制、模拟光学扩增、扩增变性和熔解曲线

12、分解五个子程序。表2校准控制程序设定温度点/30程序预热步骤设定温度持续时间/s16023953030953090507060308560956095606046051801201801801801801801067温度控制8910111213141516模拟光学扩增（此过程重复32个循环）30扩增变性15309515熔解曲线分解7.2.3温度参数校准7.2.3.1按照7.2.2中的控制程序进行温度参数的校准，启动控制程序，运行结束后，读取温度标准器的标准值和被校荧光定量PCR仪的测量值。7.2.3.2温度示值误差按公式（1）进行计算。 (1) =式中：温控装置工作区域内温度示值误差，；温控装

13、置工作区域内设定温度值，；所有测温传感器测量值的平均值，。5 JJF（黔）XX20217.2.3.3温度均匀度按公式（2）进行计算。=(2)式中：温度均匀度，；所有采样孔测量值的最大值，；所有采样孔测量值的最小值，。7.2.3.4采样孔从30上升至95过程的温度过冲量示意图见图3a），从95下降至30过程的温度过冲量示意图见图3b）。所有采样孔内温度最大过冲量按公式（3）进行计算。a）温度上升过程温度过冲量图3b）温度下降过程温度过冲量单个采样孔温度过冲量示意图= |(3)式中：采样孔内温度最大过冲量，；所有采样孔测定温度最大过冲值，。7.2.3.5如图 4所示为单个采样孔的升温速率。取50这

14、一温度点记为，90这一温度点为，到达的时间为t，平均升温速率按公式（4）进行计算。RT = 1 =1（4）式中：所有采样孔平均升温速率，/s；50第个采样孔的温度测量值，；90第个采样孔的温度测量值，；6 JJF（黔）XX2021第个采样孔到达的时间，s；采样孔的数量。7.2.3.6如图4中所示中单个采样孔的降温速率为荧光定量PCR仪从90降温至50时的温度变化，平均降温速率按公式（5）进行计算。DT = 1 =1（5）式中：所有采样孔平均降温速率，/s；第个采样孔到达的时间，s。90VRT/（/s）V /（/s）DT50t/st/s50图 4升降温速率计算模式7.2.4光学系统物理方法参数校

15、准7.2.4.1按照7.2.2中的控制程序进行光学系统物理参数的校准，启动控制程序，运行结束后，读取光学标准器的标准值和被校荧光定量PCR仪的测量值。7.2.4.2 Ct值示值误差按公式（6）进行计算。= (6)式中：所有采样孔的Ct值示值误差；荧光定量PCR仪所有采样孔测得Ct值的平均值；光学标准器所有采样孔测得Ct值的平均值。7.2.4.3 Ct值均匀度按公式（7）进行计算。=(7)7 JJF（黔）XX2021式中：Ct值均匀度；荧光定量PCR仪所有采样孔实际测得的最小Ct值；荧光定量PCR仪所有采样孔实际测得的最大Ct值。7.2.3.4 Ct值精密度按公式（8）进行计算。1 =1()2

16、100%=(8)1式中：Ct值精密度；荧光定量PCR仪第个采样孔的Ct值。7.2.4.5通道峰值高度一致性按公式（9）进行计算，线性灵敏系数按公式（10）进行计算。=（9）(10） =式中：荧光定量PCR 仪第个采样孔的通道峰值高度一致性；荧光定量PCR仪第个采样孔（ -2）时的荧光强度；荧光定量PCR仪第个采样孔（ +2）时的荧光强度所有采样孔（ -2）时的荧光强度所有采样孔（ +2）时的荧光强度；荧光定量PCR 仪第个采样孔的线性灵敏系数；荧光定量PCR 仪第个采样孔最高的荧光强度。7.2.4.6熔解温度漂移按公式（11）进行计算。=（11）式中：荧光定量PCR 仪第个采样孔的熔解温度漂移

17、，；荧光定量PCR仪第个采样孔的 值，；光学标准器的设定值，。8 JJF（黔）XX20217.2.5光学系统生物化学方法参数校准7.2.5.1荧光强度精密度在荧光定量PCR仪中随机选取（6）个采样孔。使用配制的标准荧光染料熔液进行校准，高、中、低浓度每种染料各校准1次，光学系统收集目标采样孔的数据。荧光强度精密度按公式（12）进行计算。=1(（12）= 1 )2 100%1式中：荧光强度精密度；荧光定量PCR 仪第个采样孔单次测得的荧光强度；荧光定量PCR仪测得的荧光强度的平均值。7.2.5.2样本测量精密度选用配套使用的试剂盒对高、中、低浓度DNA标准物质进行校准，每一浓度重复校准个测量孔。

18、样本测量精密度按公式（12）进行计算。= 1 =1 )2 100%(（13）1式中：样本测量精密度；荧光定量PCR仪第个采样孔单次测得的Ct值；荧光定量PCR仪测得的Ct值的平均值。7.2.5.3荧光线性相关系数将已知浓度的标准荧光染料梯度稀释后（至少稀释5个梯度）进行测量，每一浓度重复测量3次取其平均值。荧光线性相关系数按公式（14）进行计算。3=1=1()()= 3（14）)2()2式中：荧光线性相关系数；各个浓度荧光染料第次测量的标准值；各个浓度荧光染料的平均值；各个浓度荧光染料第次测量的测量值；各个浓度荧光染料的测量值平均值。9 JJF（黔）XX20217.2.5.4样本线性相关系数将

19、已知浓度的DNA标准物质梯度稀释后（至少稀释5个梯度）进行测量，每一浓度重复测量3次取其平均值。样本线性相关系数按公式（15）进行计算。3=1=1()()= 3（15）)2()2式中：样本线性相关系数；各个浓度标准物质第次测量的标准值；各个浓度标准物质的标准平均值；各个浓度标准物质第次测量的测量值；各个浓度标准物质的测量值平均值。8校准结果表达与处理8.1校准记录校准记录格式参见附录A。8.2校准结果的处理校准证书内页格式参见附录B，校准证书应至少包括以下信息：a）标题：校准证书；b）校准机构名称和地址；c）进行校准的地点；d）证书的唯一性标识、页码及总页数；e）送校单位的名称和地址；f）被校

20、准仪器的名称、生产商、规格型号及出厂编号；g）校准使用的测量标准名称、溯源性及有效性说明；h）本规范的名称、代号和对本规范的任何偏离、增加或减少说明；j）校准时的环境条件描述；k）校准结果及测量不确定度；l）校准人、核验人、批准人签名；m）校准证书签发日期；n）校准结果仅对被校仪器有效的声明；10 JJF（黔）XX2021o）未经校准机构书面批准，不得部分复制校准证书的声明。复校时间间隔9由于复校时间间隔的长短是由仪器的使用情况、使用者、仪器本身质量等诸因素所决定的，因此送校单位可根据实际使用情况自主决定复校时间间隔。建议复校时间间隔不超过12个月。11 JJF（黔）XX2021附录 A校准记

21、录格式委托方仪器名称校准日期年月日制造厂商校准地点：型号规格出厂编号温度湿度%RH其它依据： JJF(黔)*-*荧光定量聚合酶链反应分析仪校准规范计量标准器型号规格名称 (含器号)不确定度或准确度等级或最大允许误差测量范围标准器有效期至年年月月日日一、温度示值误差和温度均匀度7个温度传感器位置设定温度温度示值误差温度均匀度点/A01H01A07D07H07A12H12/305060709095二、温度最大过冲量、平均升温速率和平均降温速率设定温度点/305060709095温度最大过冲量/平均升温速率/（/s）平均降温速率 /（/s）50959550三、Ct值示值误差、Ct值均匀度和Ct值精密

22、度（物理方法）7个孔各采样孔Ct值C值示 Ct值Ct值t类别均匀精密值误差A01H01A07D07H07A12H12度度荧光定量PCR仪光学标准器四、通道峰值高度一致性、线性灵敏系数、熔解温度漂移和熔解温度比（物理方法）TmTmTm设定值ABCA-BB-CCPHCLSF/光学A0112 JJF（黔）XX2021标准器位置H01A07D07H07A12H12平均值/五、荧光强度精密度（生物化学方法）荧光强度精密标准熔液测定值平均值平均值度/%低值中值高值六、样本精密度（生物化学方法）标准熔液测定值样本精密度/%低值中值高值七、荧光线性相关系数（生物化学方法）标准熔液测定值平均值标准值线性相关系数

23、12345八、样本线性相关系数（生物化学方法）标准物质测定值平均值标准值线性相关系数13 JJF（黔）XX202112345测得值的不确定度：温度示值误差的扩展不确定度： U=Ct值示值误差的扩展不确定度： U=，k=2；，k=2。14 JJF（黔）XX2021附录 B校准证书内页格式一、温度项目校准设定温度点305060709095温度示值误差/温度均匀度/温度最大过冲量/平均升温速率/（/s）平均降温速率/（/s）50959550二、光学系统物理项目校准Ct值示值误差Ct值示值误差Ct值精密度/%7个光学标准器分布位置项目平均值A01H01A07D07H07A12H12CPHCLSFTm三

24、、光学系统生物化学项目校准低值荧光强度精密度中值/%高值低值样本测量精密度中值/%高值荧光线性相关系数样本线性相关系数测得值的不确定度：温度示值误差的扩展不确定度： U=Ct值示值误差的扩展不确定度： U=，k=2；，k=2。15 JJF（黔）XX2021附录 C温度示值误差和Ct值示值误差的测量不确定度评定示例C.1温度示值误差测量不确定度评定C.1.1被校对象荧光定量PCR仪，温度设定分辨力：1.0，校准点：温度95。C.1.2测量标准温度标准器，测温范围为（0120），最大允许误差为0.1。C.1.3测量方法将被校荧光定量PCR仪与温度标准器各部件连接完好。在精密温度传感器表面上涂抹适量

25、导热油，确保标准器与荧光定量PCR仪加热模块接触良好，参照仪器说明书设定控制程序，启动程序，运行结束后，读取温度标准器的标准值和被校荧光定量PCR仪的测量值。温度示值误差按公式（C.1）进行计算。C.1.4测量模型C.1.4.1测量模型按公式（C.1）建立。 (C.1） =式中： 温控装置工作区域内温度示值误差，；温控装置工作区域内设定温度值，； 所有测温传感器测量值的平均值，。C.1.4.2根据测量模型及测量方法，其不确定度主要来源包括被校对象测量重复性引入的标准不确定度，标准器分辨力引入的标准不确定度，标准器引入的标准不确定度。C.1.5标准不确定度分量的评定C.1.5.1测量重复性引起的

26、标准不确定度u1以温度示值误差中最大的95为例，对同一台荧光定量PCR仪，在相同的测量条件下，使用参照的温度程序运行10个循环，温度稳定后7个温度传感器的重复测量结果见表C.1。按公式（C. 2）计算合并样本标准偏差。16 JJF（黔）XX2021表 C.1温度测量结果温度传感器测量结果/测量点测量次数12345678910A01H01A07D07H07A12H1295.1195.1295.0895.1894.9995.2194.9994.8694.8894.9295.4195.3394.8394.9995.4394.8195.5295.4494.8694.9295.4294.8995.189

27、5.5894.8994.9895.1194.9295.4895.4994.7194.8795.4294.8195.3995.2894.9094.8295.5994.8595.3195.2195.1195.1695.3295.1694.9995.2794.7495.1595.0995.1195.2695.2294.7995.0695.2094.9695.2295.2094.8995.1995.1294.9995.1895.1794.9995.0795.2894.91( )2= =1 =1（C.2）(1)式中：合并样本标准偏差；第个测量点第次的测量值，； 第个测量点测量值的算术平均值，；测量点的数

28、量；每个测量点包含的测量次数。合并样本标准偏差计算结果为：= 0.14。依据测量模型，使用样本的平均值计算，则测量重复性引入的标准不确定度：1 = 7 = 0.052C.1.5.2标准器分辨力引入的标准不确定度 1标准器分辨力为0.01，分散区间半宽为0.005，服从均匀分布，则分辨力引入的标准不确定度：17 JJF（黔）XX20210.0051 = 0.0033由于重复性引入的标准不确定度大于分辨力引入的标准不确定度，两者具有一定的相关性，因此在不确定度计算时不考虑由读数分辨力引入的标准不确定度。C.1.5.3标准器引入的标准不确定度2温度标准器的最大允许误差为0.1，按均匀分布，则引入的标

29、准不确定度：0.12 = 3 = 0.058C.1.6标准不确定度分量汇总表标准不确定度分量汇总表见表C.2。表C.2温度示值误差测量结果标准不确定度分量汇总表灵敏度系数标准不确定度符号不确定度来源测量重复性标准器标准不确定度0.052-11-10.0582C.1.7合成标准不确定度表C.2中输入量不相关，则合成标准不确定度：= 1222=0.076+C.1.8扩展不确定度取包含因子 = 2，则温度示值误差的扩展不确定度：= 0.15=C.1.9不确定度报告不确定度报告见表C.3。表C.3荧光定量PCR仪温度示值误差的校准不确定度报告校准温度/95温度示值误差的校准不确定度U /( = 2)0

30、.15C.2 Ct值示值误差测量不确定度评定C.2.1被校对象18 JJF（黔）XX2021荧光定量 PCR仪，Ct值分辨力：0.01，校准点：标准 Ct值为 24.00。C.2.2测量标准光学标准器，波长范围：（360780）nm，相对光辐射强度为（10100）%。C.2.3测量方法将被校荧光定量PCR仪与光学标准器各部件连接完好。光学标准器置于被校仪器中参照仪器说明书设定控制程序，启动程序，运行结束后，读取光学标准器的标准值和被校荧光定量PCR仪的测量值。Ct值示值误差按公式（C.3）进行计算。C.2.4测量模型C.2.4.1测量模型按公式（C.3）建立。= （C.3）式中：仪器所有采样孔

31、的Ct值示值误差；荧光定量PCR仪所有采样孔测得Ct值的平均值；光学标准器所有采样孔测得Ct值的平均值。C.2.4.2根据测量模型及测量方法，其不确定度主要来源包括被校对象测量重复性引入的标准不确定度，标准器分辨力引入的标准不确定度，标准器引入的标准不确定度。C.2.5标准不确定度分量的评定C.2.5.1测量重复性引起的标准不确定度u1对同一台荧光定量PCR仪，在相同的测量条件下，使用光学标准器按照推荐的光学扩增程序对其Ct值连续进行10次重复测量，对重复测量结果进行分析，测量结果见表C.4。按公式（C.4）计算合并样本标准偏差。表C.4 Ct值测量结果Ct值重复测量结果测量点测量次数1234

32、5678910A01 23.73 23.64 23.72 24.03 23.88 23.78 23.76 23.79 23.82 23.75H01 23.90 23.89 23.91 23.93 23.96 23.92 23.93 23.89 23.93 23.8819 JJF（黔）XX2021表C.4（续）Ct值重复测量结果测量点测量次数12345678910A07 24.23 24.26 24.25 24.29 24.32 24.27 24.18 24.28 24.23 24.28D07 23.71 23.70 23.72 23.87 23.88 23.76 23.81 23.75 23.

33、74 23.82荧光定量PCR H07 24.12 24.15 24.16 24.04 24.08 24.10 24.15 24.04 24.06 24.10仪A12 23.89 23.91 23.76 23.80 23.82 23.77 23.74 23.88 23.92 23.85H12 23.86 23.87 23.67 23.80 23.72 23.75 23.77 23.81 23.84 23.84A01 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00H01 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00光学 A07 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00标准 D07 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00器 H07 24.00 24.00 24.00 24.00