原代细胞的培养与鉴定方法

1、1、大鼠骨髓来源肥大细胞原代培养并鉴定：脱颈法处死SD大鼠（体重约200g）, 75%酒精浸泡消毒3min。转入超净工 作台内操作，剪开后肢皮肤，去除腿部肌肉，暴露出股骨，尽可能将股骨外部肌 肉剥离干净，剪下股骨。剪去股骨两端的股骨头，使用5ml注射器吸取RPMI 1640基础培养基后将骨髓吹打出来，吹打过程中尽可能将骨髓冲洗干净。使用 巴氏吸管将骨髓吹打成单细胞悬液，1000rmp/min离心5min收集细胞如发现收 集的细胞中有大量红细胞时需使用红细胞裂解液处理。使用肥大细胞专用培养基 重悬细胞，接种至T25瓶内培养。培养过程中每2-3天换液一次，当发现有细胞 变圆脱落时，收集脱落细胞至新

2、的T25瓶内诱导培养，培养四周时肥大细胞诱 导成熟，取成熟的肥大细胞进行甲苯胺蓝染色鉴定;取脱落细胞培养一周、二周、 三周、四周的细胞培养上清进行组胺含量检测。2、小鼠骨髓来源肥大细胞原代培养与鉴定：小鼠经脱颈椎处死，75%酒精消毒后，取完整股骨，用1mL注射器吸取无 菌PBS从股骨一端刺入，将骨髓细胞洗出，直到骨髓腔变白。离心收集细胞， 加入3mL红细胞裂解液，室温裂解3min之后，用PBS漂洗2次。采用现配的 原代细胞培养工作液（含青、链霉素各1000U/mL，10% FBS，IL-3 10 ng/mL， SCF 10ng/mL的RPMI-1640培养基培养液）将细胞重悬，按照106个/m

3、L接种 于六孔板中，每孔加3mL培养液，置于37C，5% CO2的培养箱中培养，每7d 将悬浮细胞按照106个/mL转移到新的培养板中，继续培养，4-6周细胞分化成 熟。四周后收集悬浮细胞，部分细胞用于流式检测纯度，部分用含10% FBS的 RPMI-1640培养基重新接板。纯度检测：向诱导分化细胞中按1： 200加入 肥 大 细 胞表面 标志物APC-CD117，FITC- FceRI，o4C孵育60min，无菌PBS 漂洗3次，流式检测肥大细胞纯度。（SCF： Stem cell factor，干细胞因子；又称肥大细胞生长因子 MGF）3、大鼠腹腔肥大细胞的分离与培养：选用体重220-25

4、0g的SD大鼠。颈椎脱臼法处死，置于75%酒精中浸泡约2min后取出，在无菌超净台内完成后续操作。无菌注射器向腹腔内注射15 MlRPMI 1640培养基（含10U/mL肝素）,轻柔按摩大鼠腹部约90s；打开腹腔，尽可能多地抽取腹腔液与50 mL离心管，4C, 150g，离心10min,弃去上清；PBS 清洗，用200目筛网过滤收集细胞，4C, 150g，离心10min，弃去上清，PBS 重悬细胞；配制90% Percoll溶液，将细胞悬液与90% Percoll溶液（淋巴细胞分 离液）按1： 4的比例充分混合，后在其上轻轻覆盖1mLPBS，4C，150g，离 心25min，弃去上清；PBS清

5、洗2次，4C，150g，离心6min；将细胞重悬于含 10% FBS的RPMI 1640培养基（加入1%青霉素、链霉素），接种于细胞培养皿中，置于5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。肥大细胞表面标志物APC-CD117，FITC- FcsRIa，4C孵育 60min，无菌 PBS 漂洗 3 次，流式检测 肥大细胞纯度。（肥大细胞的激活：C48/80刺激细胞脱颗粒，20pg/mL； IgE刺激细胞脱颗粒，1g/mL Purifird Rat IgE。文献：温度对大鼠腹腔肥大细胞和RBL-2H3细胞活力和功能的影响。）4、小鼠BMSCs的原代培养与鉴定脱颈法处死C57小鼠，在75%乙醇中浸泡5

6、min，转移至超净工作台中，无菌 条件下分离出小鼠的长骨（股骨和胫骨），浸泡于PBS溶液中。对股骨和胫骨进行 深层次解剖，去除附着的肌肉组织，剪掉长骨两端的十骺端，用10%FBS，DMDM 培养基反复冲洗骨髓腔，直至骨髓腔发白，收集洗涤液，用移液枪轻轻吹散分离 为单个细胞。细胞接种于六孔板中培养，轻微摇匀，使细胞在孔中均匀分布，放 置于37C、5%CO2培养箱中静置培养，使BMSCs充分贴壁。培养48h后换液，用 预热的PBS缓冲液轻轻洗涤细胞2次，添加新鲜培养基，之后每隔48h换液1次， 原代培养至细胞铺满80 %进行传代培养。待原代细胞传代至P3代时，进行成脂、成骨诱导分化，流式标记对BM

7、SCs 进行鉴定。BMSCs成脂诱导分化：、对照组：BMSCs不作处理、成脂组：BMSCs+成脂诱导剂上述两个实验组，每组三个重复孔，BMSCs铺于六孔板（细胞爬片），细 胞融合达80%以上后，弃去原培养基，更换新鲜培养基，成脂组加入成脂诱导剂 （成脂肪诱导剂成分为10 -6 mol/L地塞米松+ 5x10 -4 mol/L IBMX+ 2x10 -4 mol/L 吲噪美辛+10四g/ml胰岛素）3d换液1次，分化18d。待脂滴形成后，PBS缓冲液清 洗3次，10%中性甲醛固定10min，再用PBS缓冲液清洗2次，进行油红O染色，拍 照记录。BMSCs成骨诱导分化：、对照组：BMSCs不作处理

8、、成骨组：BMSCs+成骨诱导剂上述两个实验组，每组三个重复孔，BMSCs铺于六孔板（细胞爬片），细 胞融合达80%以上后，弃去原培养基，更换新鲜培养基，成骨组加入成骨诱导剂 （成骨诱导剂成分为10-8mol/L地塞米松+50四g/ml维生素C+ 10mmol/L。-甘油磷 酸钠）。3d换液1次，分化21d，21d后用茜素红染色，观察结果并拍照。BMSCs成软骨诱导分化：、对照组：BMSCs不作处理、成软骨组：BMSCs+成软骨诱导剂上述两个实验组，每组6个重复孔，每组3孔用于ICC，另3孔用于甲苯胺蓝 染色。BMSCs铺于六孔板（细胞爬片），细胞融合达80%以上后，弃去原培养 基，更换新鲜培

9、养基，成软骨组加入成软骨诱导剂（50四g/ml维生素C +100nmol/L 地塞米松+100四g/mL丙酮酸钠+50mg/mL ITS +5.35四g/mL亚油酸+ 10ng/mLTGF-pi + 1.25ng/mL BSA），培养3周后进行II型胶原免疫组化（ICC）， 取另3孔进行甲苯胺蓝染色。流式细胞仪鉴定：收集P3代生长状态良好的细胞，用PBS （含1% BSA）清洗细胞3次，计数细 胞，重悬细胞后流式检测表面标记CD34、CD29、CD45、CD90的表达情况。5、大鼠PMVEC细胞的原代培养与鉴定：取成年SD大鼠（体重约200g），静脉注射麻醉同时注入肝素钠，麻醉成功 后用体积分

10、数75%乙醇浸泡全身（头部以下）消毒5 min，将大鼠固定于超净工作台内，用外科剪、镊逐层剪开胸腔，切下心肺并放入盛有含200IU/ml青霉素 和200ug/ml链霉素的D-Hanks液的培养皿内。用D-Hanks液冲洗心肺组织的血 迹，用眼科剪、镊去除肺组织表面的脏层胸膜，剪取胸膜下肺组织，将组织剪碎，用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，接种T25瓶（需先用1%明胶进行包被）， 放入37C, 5%CO2培养箱中培养，待细胞稳定贴壁后，更换使用ECM培养液 （微血管内皮细胞专用培养基、含内皮细胞生长因子，根据后续实验约需3瓶， 500ml/瓶）进行筛选纯化，根据细胞生长状态每2-3d更换一次

11、培养液，细胞汇合 度达到85-90%时进行传代。PMVEC细胞传代至P3代时进行细胞细胞爬片，以 六孔板计，每孔接种5*105个细胞，待细胞爬满玻片后，使用CD31抗体进行免 疫荧光鉴定，每个抗体检测三孔，阳性细胞达到90%方可用于后续实验。6、大鼠破骨细胞的原代培养：薄骨磨片的制备及处理：取新鲜成年牛股骨皮质（市售）-20 C贮存。临用前 锯成1 cm宽条后，用磨片机磨成厚50pm的Icmxlcm骨片，蒸馏水清洗10次， 置于75%的乙醇浸泡24 h,自然晾干，紫外线照射消毒骨片的两面，放于DMEM 培养基中4C备用。玻片的制备：将玻片切成1 cmx1cm大小，泡酸过夜，自来水冲洗干净，蒸

12、馏水洗3遍,，烤箱烤干，高压消毒灭菌后备用。破骨细胞的分离培养：大鼠麻醉后断颈处死，无菌取其四肢长骨，在磷酸盐 缓冲液中尽可能去除附着在其表面的全部软组织。将骨干置于DMEM培养基（10% 的胎牛血清，4 pmol/L谷氨酰胺）中，然后纵行剖开，刮骨髓腔及靠近干骺端处 内表面直至骨干成为极微小的碎片，300目筛网过滤，吸管反复吹洗筛网上残渣， 吸取滤过悬液，置入离心管内，4 C 1 000 r/min离心10 min，弃上清，加4mL DMEM培养基吹打均匀，接种于24孔板，24孔板内分别放置制备的玻片和骨 片，置于培养箱培养，培养一段时间后（时间根据细胞生长状况进行确定）进行 TRAP染色与

13、噬骨能力检测，对细胞进行鉴定，每个指标检测三个重复。（取盖 玻片进行TRAP染色，取培养液中的骨片检测噬骨能力检测，用扫描电镜观察骨 片上的陷凹情况，以判定噬骨能力）7、大鼠血管内皮细胞的原代培养：SD大鼠除头部以外浸入75%的乙醇杀菌，随后移入无菌操作台，剖开胸腹 腔，取胸主动脉，置于预冷的无菌PBS液，去掉外结缔组织，反复重洗管腔，清 除残留的血细胞。清除细小的动脉分支，更换培养皿与PBS，将动脉一端轻轻提起，注意不损伤到内膜。将动脉剪成厚度约为1.5mm的动脉环，将动脉环移入T25 培养瓶、每瓶接种15-20个动脉环，加入DMEM培养基（20%FBS、青链霉素）， 使培养液刚刚没过动脉环

14、，动脉环需均匀分布于瓶底，将培养瓶在培养箱内静置 培养60小时，弃去动脉环。更换新鲜培养液，根据细胞生长状态每2-3d更换一次 培养液，细胞汇合度达到85-90%时进行传代。细胞传代至P3代时进行细胞细胞 爬片，以六孔板计，每孔接种5*105个细胞，待细胞爬满玻片后，使用Factor VIII （vwf）抗体、CD31抗体进行免疫荧光鉴定，每个抗体检测三孔，阳性细胞达到 90%方可用于后续实验。（与主动脉内皮细胞培养方法一致）8、大鼠主动脉平滑肌细胞原代培养与鉴定：SD大鼠经颈椎脱臼致死,75%乙醇浸泡消毒3min，固定后依次剪开胸腹部皮 肤，肌肉及胸骨，暴露胸腔，紧靠脊柱右前方，从主动脉弓至

15、膈面处剪下胸主动脉，并 放入盛有PBS缓冲液的细胞培养皿中，迅速转入细胞培养室的超净工作台。眼科直 镊和弯镊去除血凝块和血管外膜层，然后转移入另一盛有PBS缓冲液的细胞培养 皿中,剪去血管外的小分支。再转移入含20%胎牛血清和DMEM混合液的细胞培 养皿中,眼科直剪剪开血管腔，内膜面向上，以眼科弯镊或手术刀片轻轻擦拭内膜 层，以去除内皮细胞。最后转移入另一含20%胎牛血清和DMEM混合液的细胞培 养皿中，用眼科剪将血管段剪成1mm X 1mm大小的组织块，用吸管把组织块转入 T25细胞培养瓶中，并均匀贴壁于培养瓶底面，组织块的间距为0.5cm。盖好瓶盖， 轻轻翻转培养瓶，让瓶底朝上，并向瓶内注

16、入适量20%胎牛血清和DMEM混合液以 及相应比例的青链霉素混合液，置于37C，5% CO2培养箱内放置35h，使得组织 块干涸，并与瓶底贴附，将培养瓶慢慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中，继续 静置3天，切勿移动,45天会有细胞从组织块周围游离出，即可换液进行培养。细 胞传代至P3代时进行细胞爬片，以六孔板计，每孔接种5x105个细胞，待细胞爬 满玻片后，使用o-SM-actin抗体进行免疫荧光鉴定，每个抗体检测三孔，阳性细 胞达到90%方可用于后续实验9、人正常角质形成细胞与成纤维细胞原代培养：取健康儿童包皮环切手术后的残余皮肤组织，经dispase酶消化后，分离表 皮与真皮、再经Typ

17、sin-EDTA （0.25%）分别消化，表皮消化后形成的角质形成 细胞接种于W型胶原包被过的细胞培养瓶中进行原代培养（角质形成细胞专用培养基，Keratinocyte Medium-defined），真皮消化后形成的成纤维细胞接种于Fibroblast Medium serum free 培养基（成纤维细胞专用培养基）中进行培养。传代至 P5代时，进行免疫荧光鉴定，其中原代培养的角质形成细胞用pan-Cytokeratin 抗体进行鉴定，成纤维细胞用vimentin与cytokeratin15抗体进行鉴定。10、脐带血间充质干细胞的原代培养与鉴定：脐带血间充质十细胞的分离培养：从胎盘脐静脉穿

18、刺抽取15 mL脐带血，肝 素抗凝，加等量磷酸缓冲液稀释，取 50 mL离心管，先加入 15 mL密度 1.077g/mL的Percoll梯度分离液，小心加入稀释后的脐带血，2 000 r/min离心 25 min后，用吸管吸取分层界面的白色环形絮状物（富含单个核细胞），800 r/min 离心洗涤2次，5min/次，沉积细胞用含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL 链霉素的DMEM高糖培养基悬浮，调整细胞密度为1X109/L，接种于25 T的培养 瓶内，放置在37C、体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱中培养。孵育72 h后更 换培养基，去除红细胞及其他未贴壁细胞，以后视

19、细胞生长情况平均三四天换液 1次。BMSCs成脂诱导分化：、对照组：BMSCs不作处理、成脂组：BMSCs+成脂诱导剂上述两个实验组，每组三个重复孔，BMSCs铺于六孔板（细胞爬片），细 胞融合达80%以上后，弃去原培养基，更换新鲜培养基，成脂组加入成脂诱导剂 （成脂肪诱导剂成分为10 -6 mol/L地塞米松+ 5x10 -4 mol/L IBMX+ 2x10 -4 mol/L 吲噪美辛+10g/m胰岛素）3d换液1次，分化18d。待脂滴形成后，PBS缓冲液清 洗3次，10%中性甲醛固定10min，再用PBS缓冲液清洗2次，进行油红O染色，拍 照记录。BMSCs成骨诱导分化：、对照组：BMS

20、Cs不作处理、成骨组：BMSCs+成骨诱导剂上述两个实验组，每组三个重复孔，BMSCs铺于六孔板（细胞爬片），细 胞融合达80%以上后，弃去原培养基，更换新鲜培养基，成骨组加入成骨诱导剂 （成骨诱导剂成分为10-8mol/L地塞米松+50四g/ml维生素C+ 10mmol/L。-甘油磷 酸钠）。3d换液1次，分化21d，21d后用茜素红染色，观察结果并拍照。BMSCs成软骨诱导分化：、对照组：BMSCs不作处理、成软骨组：BMSCs+成软骨诱导剂上述两个实验组，每组6个重复孔，每组3孔用于ICC，另3孔用于甲苯胺蓝 染色。BMSCs铺于六孔板（细胞爬片），细胞融合达80%以上后，弃去原培养 基

21、，更换新鲜培养基，成软骨组加入成软骨诱导剂（50四g/ml维生素C +100nmol/L 地塞米松+100四g/mL丙酮酸钠+50mg/mL ITS +5.35四g/mL亚油酸+ 10ng/mLTGF-pi + 1.25ng/mL BSA），培养3周后进行II型胶原免疫组化（ICC）， 取另3孔进行甲苯胺蓝染色。（参考文献：人脐带血间充质干细胞分离培养及向软骨细胞的分化）11、人黑素细胞的原代培养与鉴定取健康儿童包皮环切术标本，经75%乙醇浸泡10min后，用含高浓度青霉素/ 链霉素的生理盐水反复冲洗，剪去皮下组织，修剪为5mmX10mm的细条。用 Dispase II酶37 C消化12h，分离表、真皮。获取的表皮加入0.1%胰酶（含 0.53mmol/L EDT