《细胞原代培养》PPT课件

1、细胞的原代培养（研究生实验教学）实验目的熟悉细胞培养的基本条件和准备工作熟悉并掌握原代培养中取材、消化、收集细胞和接种等基本实验技术了解细胞原代培养的原理及其方法实验原理原代培养（primary culture） 从供体取得组织细胞在体外首次培养。 细胞分化、药物测试、细胞株建立等基本方法 组织块法和消化法 a.组织块法：直接将组织块接种于培养瓶，24小时就有细胞向四周游出。 简便、易行，适合于来源有限、数量较少的组织做原代细胞培养b.消化法用酶消化、分解妨碍细胞生长的间质（基质、纤维等），形成单个细胞或细胞团对上皮、肝、肾、胚胎等间质少、较软组织选择胰蛋白酶对骨、前列腺、癌组织等纤维多、较硬

2、的组织可用胶原酶短时间内可获得大量活细胞主要实验器材培养箱 二氧化碳恒温箱，5CO2，37，保持湿度，消毒灭菌。倒置显微镜 可观察活细胞，直接观察培养瓶或培养板，带拍摄等功能。离心机 普通离心机（5004000rpm），高速离心机（100015000），冷冻离心机等 （离心力转换成转速： g 1.118r2105）超净工作台 紫外消毒，鼓风，保持干净、整洁高压锅 用电，带压力表，自动恒压，掌握时间 橡胶、塑料、药品15，金属20培养瓶 玻璃瓶和塑料瓶，洗涤要干净，临时消毒培养基 a.天然培养基：血清、胚胎浸出液、水解乳蛋白等 b.合成培养基：DMEM、RPMI1640、199培养基等 c.无血

3、清培养基：Ham F12和DMEM混合的基础培养基、自行设计与配制的培养基（加其他成分） 其它常用液消化液 0.25胰蛋白酶溶液、0.02%EDTA溶液、胶原酶。消化酶抑制剂 0.10.5大豆胰酶抑制剂NaHCO3溶液 常用浓度7.4、5.6、3.7HEPES溶液（羟乙基哌嗪乙硫磺酸） 终浓度1050 mmol/L抗生素液 青霉素和链霉素二者的终浓度都达到100U/ml主要实验准备工作一、培养用具的清洗浸泡 清水浸泡数小时，新玻璃器皿泡5稀盐酸12h以上（中和表面碱性物质）洗刷 洗洁精、软毛刷，轻刷、多次、彻底浸酸（由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水配制） 灌满，6h以上，最好过夜，去污好冲洗 充分，

4、灌满-倒出10次以上，最后蒸馏水冲23次，烘干、包装。胶塞和塑料用品清洗 清水浸泡后，2NaOH溶液煮沸10min,自来水冲洗、晾干，1稀盐酸浸泡30min,自来水冲洗，双蒸水冲3次，晾干、包装。二、物品包装 同类物品包装一起，大小合适，包扎紧凑，多层包装，写上标签三、消毒器具常用压力蒸汽灭菌 掌握时间：煮沸1020min试剂消毒 无机试剂可用压力蒸汽灭菌（插57针头） 有机试剂过滤除菌，常用0.22m超净工作台 紫外灯照射30min以上培养室 紫外灯照射23h/天操作步骤1.取材75酒精浸泡乳鼠2min，取肝脏于平皿中PBS溶液洗涤3次去除液体后，剪碎成12mm3小块2.消化加58倍组织量的胰蛋白酶溶液转移到离心管内，加盖37水浴15min，每5min摇晃1次终止消化：加1ml含血清的培养基DMEM3.过滤用400目不锈钢筛网过滤收集滤液于离心管4.离心平衡、离心5min，10001500 rpm去上清，加PBS，混匀，离心（同上）重复