2精读-l和乳酸通过抑制组蛋白去乙酰化酶活化羟基酸受体1增强dna修复介导宫颈癌细胞对抗肿瘤药物的耐受

1、【肿瘤】肿瘤耐药与 DNA 修复（二）标题图第 1 部分进来有思路精要乳酸通过抑制组蛋白去乙酰化酶（HDACs）调控表达，通过羟基酸受体 1（HCAR1）调控肿瘤细胞存活，本文献主要是探究 L-和 D-乳酸在宫颈癌细胞中对 DNA 损伤反应的作用。研究发现 L-和D-乳酸可以抑制 Hela 细胞中 HDACs 的活性使 H3H4 高乙酰化、降低染色质的紧实度。乳酸处理细胞后可以导致 LIG4、NBS1 和 APTX 的表达提高近两倍并增加 DNA-PKcs 活性，在含有乳酸的培养基中培养细胞可以提高DNA 修复速率。进一步研究发现乳酸调控肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性，在研究的细胞株中其细胞表面

2、均有 HCAR1 存在，下调 HCAR1 降低 DNA修复效率、破坏对 L-乳酸的反应并降低 D-乳酸对细胞的作用，干扰 HCAR1后发现单羧酸转运蛋白 4 的 mRNA 水平显著降低。用抑制剂抑制单羧酸转运蛋白后能抵消乳酸对细胞 DNA 修复能力和细胞存活能力的加强效果。的阅读人群临床科室肿瘤疾病模型肿瘤耐药与 DNA 修复文献档次杂志名称Cell Communication and Signaling年份2015影响因子5.093标题英文题目L- and D-lac e enhance DNA repair and modulate theof cervical carcinoma cel

3、ls to ancer drugs via histone deacetylase inhibition and hydroxycarboxylic acid receptor 1 activation中文题目L-和 D-乳酸通过抑制组蛋白去乙酰化酶和活化羟基酸受体 1 增强 DNA 修复和介导宫颈癌细胞对抗肿瘤药物的耐受第 2 部分 背景介绍临床现象宫颈癌细胞对抗肿瘤药物耐受科学问题乳酸对宫颈癌耐药的机制分子机制研究切入点L-和 D-乳酸在表达和 DNA 损伤修复方面的功能研究对象乳酸对宫颈癌耐药的作用第 3 部分 研究内容一、 L-和 D-乳酸通过一直组蛋白去乙酰化酶促进组蛋白乙酰化已知

4、L-和 D-乳酸都能在体外抑制 HDACs，而对于体内的影响并无报道。丁酸钠是 HDAC 抑制剂，用作对照，发现 D-乳酸比 L-乳酸能更有效的抑制胞内 HDAC 活性。L-乳酸、D-乳酸和丁酸钠的 IC50 分别为 12412、324 和 0.40 0.01 mM，在乳酸和丁酸钠处理时，H3 和 H4 的乙酰化水平与剂量相关。20mM L-和 D-乳酸（宫颈中的生理浓度）对 HDAC 的抑制作用和组蛋白的高乙酰化现象说明了乳酸在体内使 HDAC 活性减弱。同时丁酸钠的作用浓度为 0.25-0.5mM。二、 乳酸和丁酸钠使组蛋白高乙酰化导致染色质紧实度降低组蛋白赖氨酸乙酰化后降低了组蛋白的阳离

5、子量，破坏 DNA 和组蛋白之间的电荷互作，从而导致染色质趋于松散的状态。乳酸和丁酸钠都能抑制 HDAC 活性导致 H3、H4 乙酰化积累，发现乳酸和丁酸钠分别在10-20mM 和 0.25-2.5mM 处理细胞 24h 后，染色质紧实度降低。分局染色细胞计算变异系数（CV）发现，2.5mM 丁酸钠处理的细胞 CV 下降了 8%，20mM 的 L-和 D-乳酸处理后的细胞 CV 下降不明显。三、 L-和 D-乳酸增强抗肿瘤药物引起的 DNA 双链断裂的修复已有研究发现 H3、H4 的修饰能直接影响细胞的 DDR，为了应对 DNADSBs，H2AX 组蛋白磷酸化形成 H2AC，H2AC 的形成是

6、 DNA DSBs 的标志。分别用阿霉素（DOX）、顺铂（CDDP）和新制癌菌素（NCS）处理细胞，检测乳酸对细胞 DDR 的影响。Hela 细胞经乳酸（L-/D-）处理 24h后，然后用抗肿瘤药物处理 30min，随后检测 H2AC 的形成，发现 L-和D-乳酸都能极大的增加 H2AC 的形成。L-和 D-乳酸都能大幅增加抗肿瘤药物引起的 DNA 损伤的修复，这种加强在 DOX 和 CDDP 处理时尤为明显。四、 L-或 D-乳酸诱导 DNA 修复相关的表达由于乳酸处理后引起细胞染色质结构的变化，促进 DNA 趋于松散，接下来探究乳酸对 DNA 修复蛋白表达的影响。检测了 23 个与 DNA

7、：碱基切除修复（LIG3、XRCC1、PNKP、PARP1 和修复相关的主要PARP2）、同源重组（HR）（RAD51、BRCA1、BRCA2、RAD50、MRE11A和 NBS1）、非同源末端加入（NHEJ）（XRCC6、XRCC5、PRKDC、LIG4、XRCC4、DCLRE1C、WRN、NHEJ1、APTX 和 PARD3）和 DDR（ATM、ATR、TP53 和 MDC1）。发现乳酸能极大的增加 NBS1、LIG4 和 APTX 的表达。五、 乳酸导致 DNA-PKcs 核激活有H3 乙酰化能启动DNA-PKcs 激活和从核质到核仁的迁移，DNA-PKcs 时参与NHEJ 的关键酶，D

8、NA DSBs 促进DNA-PKcs 在 Ser2056位点的磷酸化，因此 p-DNA-PKcs 是 NHEJ 活性的标志。检测 NCS 处理后DNA-PKcs 的磷酸化水平，发现乳酸预处理的细胞 psER2056-DNA-PKcs水平增加。用 L-和 D-处理细胞，DNA-PKcs 阳性细胞分别增加了 11%和7%。乳酸引起的 DNA-PKcs 活化同时也增加了 DNA-PKcs 在细胞核的免疫反应。可见，乳酸能激活 DNA-PKcs 参与 DNA 修复。六、 L-和 D-乳酸增强抗肿瘤药物处理后的宫颈癌细胞的生存能力Hela 细胞用 L-D-乳酸处理后用 DNA 损伤的抗肿瘤药物处理，发现

9、乳酸并不影响 Hela 细胞的正常生长，但是却能极大的提高细胞在药物处理后的生存能力。乳酸对细胞的保护作用在 NCSDOXCDDP 作用时尤为明显，其中，L-乳酸对 NCS 的抗性保护作用更好，D-乳酸对 DOX 的抗性保护作用更好。另外，有测试了 Ca Ski 和 C33A 宫颈癌细胞株乳酸对抗 NCS的效果，两种乳酸均能有效的保护宫颈癌细胞，这说明乳酸对肿瘤细胞对抗化疗药物的保护作用不仅限于 Hela 细胞，对其他宫颈癌细胞依然有效。七、 宫颈癌细胞中 HCAR1 大量存在有研究发现胰和细胞的生存需要 HCAR1，检测 Hela，CaSki 和 C33A 细胞在应对化疗药物时，HCAR1

10、的表达情况，发现在 Hela细胞中，HCAR1 水平最高，进而在 Hela 细胞中检测乳酸对 c形成（HCAR1 抑制腺苷酸环化酶）和 Erk 磷酸化水平的作用，发现乳酸对弗处理的 Hela 细胞中的 c有依赖剂量的抑制作用，其中 L-乳酸的抑制作用高于 D-乳酸。L-乳酸处理 5min 内可以激活 MAPK 信号通路，而 D-乳酸能更有效的刺激 Erk 磷酸化，可能参与介导 Erk 信号通路活化，这说明 L-和 D-乳酸在胞内作用于不同的受体通路。PTXU0126 预处理能阻断乳酸对 Erk 的磷酸化促进作用。八、 百日咳毒素破坏乳酸对宫颈癌细胞的保护作用用 HCAR1 特异性激动剂 3,5

11、-DHBA 处理 24h 后用 NCS 处理，3,5-DHBA 能显著增加H2AC 的形成，PTX 能抑制Gi/o 蛋白阻断 35,-DHBA对 H2AC 的促进作用。L-D-乳酸处理的细胞用 PTX 处理后，应对 NCS却无 H2AC 形成。九、 HCAR1 和 MCT 活性对乳酸的作用用 L-D-乳酸和 NCS 处理 Hela（WT, shRNA, HCAR1-shRNA），发现 HCAR1 沉默后 DNA 修复效率大幅降低，HCAR1 的沉默阻断了乳酸对DNA 修复的作用。已知 HCAR1 和 MCT 的表达与肿瘤细胞在微环境中的生存相关，本实验发现 HCAR1 沉默后，MCT1, MC

12、T2, MCT4 的 mRNA 水平分别下降了 10，21%，60%。用 MCT 抑制剂 -CHCA，乳酸，NCS处理细胞，发现 -CHCA 的处理对细胞与 NCS 后的生存率和 DNA 修复情况没有明显影响。但是，-CHCA 阻断了 L-和 D-乳酸促进细胞在 NCS处理后的 DNA 修复，也抵消了乳酸对细胞在 NCS 存在时的保护作用。可见，MCTs 转运胞外乳酸与 HCAR1 相协调参与乳酸对肿瘤细胞生存和DNA 修复的作用。第 4 部分 思路总结细胞表型乳酸促进宫颈癌细胞抗化疗药物分子机制乳酸由 MCTs 转运至胞内，导致 HDACs 活性受到抑制，使 H3 和 H4 高乙酰化修饰，促进染色质趋于松散，DNA 修复相关上调表达，DNA-PKcs核激活，乳酸产生的 DNA 修复效应极