干扰RNA文库在功能基因筛选中的应用课件

1、RNA干扰文库及其应用RNAi的概况SiRNA类型RNAi文库（RNAi library)RNAi文库的分类RNAi文库的构建策略RNAi文库在功能基因组研究中的应用RNAi library技术需要注意的问题RNAi概况RNAi(RNA interference ，RNA干扰)：短双链RNA（dsRNA）诱导靶基因mRNA特异性降解，或阻止mRNA翻译，产生基因沉默（gene silence)的现象。因此，又称为knockdown。1995年，康乃尔大学的Su Guo用反义RNA技术抑制par-1基因时，意外发现正义RNA（sense RNA）也能抑制C. elegans par-1基因表达。

2、1998年，Andrew Fire和Craig Mello揭示正义RNA抑制基因表达是由于混有双链RNA。RNAi现象普遍存在动植物体内。发现植物中的21-25nt的RNA分子诱导PTGS（post-transciption gene silence，转录后基因沉默）。2001年，Emily等在果蝇中确定了降解dsRNA的关键酶，并命名为Dicer，此酶属于RNaseIII家族，在进化上保守。 SiRNA的类型寡核苷酸SiRNA：人工合成、体外转录特点：易于设计、合成昂贵、瞬时表达吗啡啉核苷SiRNA：人工合成RNA类似物。特点：结合力强，不易降解，效率高载体表达型SiRNA（细菌质粒、病毒载

3、体）：基于表达载体在细胞内表达。特点：稳定表达、可大量扩增，转染效率低，操作繁杂RNAi的机制细胞自然存在二种干扰RNAsiRNA（短干扰RNA）：19-25nt，由长dsRNA裂解而成的小片段，诱导mRNA降解。 microRNA(miRNA) ：22nt，呈短发夹结构（short hairpin RNA，shRNA），由miRNA前体酶解而成，抑制mRNA翻译。线虫晚期miRNA的形成早期胚胎发育过程中miRNA参与细胞分化病毒或基因重组siRNA的形成及作用 RNAi 的基本过程：siRNA形成：dsRNA被Dicer酶剪切成siRNA，消耗能量；RISC（RNA-induced sil

4、encing complex）形成：与RNAi辅助蛋白argonaute家族分子、RNA依赖性聚合酶结合形成RISC，消耗ATP能量； RISC 活化：siRNA解螺旋成单链，无活性的复合体转变成活性形式；阻止翻译或诱导mRNA降解：在siRNA引导下，RISC识别并切割互补的靶RNA，无需或消耗少量ATP。RNAi library人工构建的一系列能对众多基因表达进行干扰的siRNA或shRNA文库。RNAi library分类已知基因RNAi library基因家族RNAi library信号通路RNAi library结构域RNAi library全基因组RNAi library随机序列R

5、NAi libraryRNAi library的构建策略三种方案 化学合成 体外转录 体内生物合成（采用RNA转录载体）（一）化学合成（二）体外转录体外转录合成siRNA以人工合成的寡DNA片段为模板以cDNA基因为模板（三）体内转录合成用RNA转录载体（质粒、病毒载体）构建RNAi library通常采用Pol III启动子 U6或H1作为启动子Pol III启动子特点：总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到45个连续的U即终止，非常精确。（五）RNAi library的形式双启动子互补形式串联形式（tandem type）发夹形式（harpin type）siRNA文库（

6、双启动子互补）（四）构建方法1、根据靶基因序列，人工合成序列特异DNA片段插入到RNA表达载体2、体外合成随机简并DNA片段插入到表达载体中3、REGS（restriction enzyme generated siRNA)方法：cDNA片段文库两端接上限制性酶切位点，插入到表达载体中（常采用BsmB1、BspM1酶。4、miRNA前体序列替换方法shRNA文库（特异DNA序列法）siRNA文库（随机序列法）REGS法miRNA前体序列替换方法发夹结构SiRNA的抑制效率比串联结构的SiRNA的效率更高但发夹结构SiRNA存在二个严重的问题一是更难设计发夹结构序列二是有20-40%的发夹结构在

7、细菌中会发生碱基突变MIYAGISHI M and TAIRA K的研究结果如何确定作用靶序列RNAi的特点：SiRNA的效率取决于mRNA序列随机SiRNA只有20-40%有较好的效果对哺乳动物细胞，最有效的siRNAs是21-23个碱基大小、3端有两个突出碱基的双链RNA；而对非哺乳动物，比较有效的是长片段dsRNA。多种因素会影响SiRNA的效率，有必要建立靶序列的运算法则设计原则：GC含量在30%50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。 避免在5和3端的非编码区（untranslated regions，UTRs)设计siRNA 选用靶基因特异且保守的序列SiRNA的特异性取决于靶序列的特异性，与其他同源基因超过3nt/21nt差异，就有较高的特异性。少于1nt/21nt差异，有非特异作用设计阴性对照siRNARNAi library的应用基因功能分析胚胎发育与干细胞基因调控研究细胞增殖与分化基因调控研究细胞生长与转移基因调控多基因疾病发病机制研究表观遗传学分析（RNAi可诱导基因甲基化）信号通路新分子的筛选与鉴定寻找新的药物靶标、基因治疗药物作用机制探讨应用RNAi library技术需要注意的问题了