头孢卡品酯微生物方法验证

1、头孢卡品酯微生物限度验证方案起草日期分发部门机密等级：机密目录（例）1方案批准文件22验证方案2目的2范围2概述2职责6计划6测试项目6实施步骤6可接受标准6测试结果62.10漏项和偏差报告62.11报告62.12附件71、方案批准文件对头孢卡品酯的微生物限度检查法验证试验需要用到的相关SOP进行确认微生物实验室操作管理规程培养基管理规程洁净工作台使用、维护保养操作规程生化培养箱使用、维护保养操作规程立式压力灭菌器使用、维护保养操作规程微生物限度检验仪使用、维护保养操作规程2、验证方案目的：在进行常规的微生物限度检查之前，需验证在实际检验条件下，检验用物品（包括供试品、稀释液、培养基以及检验用

2、具等）及操作程序不得对可能存在的微生物的生长造成不良影响。本试验是关于头孢卡品酯微生物限度检查方法的验证。结果应显示，头孢卡品酯微生物限度检查方法符合验证要求。范围：适用于头孢卡品酯微生物限度检查法的离心沉集与薄膜过滤联合使用法。概述：由于需要建立本产品的微生物限度检查方法，因此需要对本产品进行方法的验证，此微生物限度检查方法验证需要在其它各个系统（诸如灭菌设备、公用系统、空调系统、设备验证等）验证工作完成的基础上进行的。职责：质量控制部微生物检验员对本方案的实施严格的操作。2.5计划：计划实施验证时间为至2.6测试项目：头孢卡品酯微生物限度检查方法验证。实施步骤：试验用菌液制备取经3035C

3、培养1824h的金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、大肠埃希菌的营养肉汤培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-510-7，使成50100CFU/ml，经活菌计数后备用；取经2328C培养2448h的白色念珠菌的改良马丁液体培养物1ml,用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-510-6,使成50100CFU/ml,经活菌计数后备用；取经2328C培养57天的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液5ml洗下黑曲霉抱子，吸出抱子悬液1ml，加0.9%无菌氯化钠溶液适量稀释至与标准比浊管浊度相当的抱子悬液，取抱子悬液1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-4,

4、使成50100CFU/ml,经活菌计数后备用。头孢卡品酯微生物限度检查方法验证细菌计数方法的验证2.7.2.1.1样品试验组取头抱卡品酯样品10g，加入200mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，充分振摇，混匀，作为1：20的供试液。取1:20供试液10ml，先以500转/分钟离心3分钟，取全部上清液混匀作为供试液，取2ml供试液加至4045C90ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中混匀过滤，冲洗三次，每次100ml，并在最后一次冲洗液中加入50100cfu/ml大肠埃希菌,滤干后即制得滤膜，每株试验菌平行制备2张滤膜，将滤膜正面朝上贴于营养琼脂培养基上，进行培养计数。按上述方法同法

5、处理金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌。菌液组取试验用菌液1ml,分别注入平皿，立即倾注冷却至45C营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，测定所加的试验菌数。供试品对照组取1：20供试液10ml，先以500转/分钟离心3分钟，取全部上清液混匀作为供试液，取2ml供试液加至4045C90ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中混匀过滤，冲洗三次，每次100ml，平行制备2张滤膜，将滤膜正面朝上贴于营养琼脂培养基上，进行培养计数。计数结果计算：X=AXK，X为菌数（cfu/g）；A为菌落平均数；K=10。稀释剂对照组取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分别加入试验菌（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和

6、枯草芽抱杆菌），使最终菌浓度为50100cfu/ml，以此加入试验菌的缓冲液作为供试液。取上述供试液10ml，先以500转/分钟离心3分钟，取全部上清液混匀作为供试液，取2ml供试液加至4045C90ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中混匀过滤，冲洗三次，每次100ml，每株试验菌平行制备2张滤膜，将滤膜正面朝上贴于营养琼脂培养基上，进行培养计数。计数结果计算：X=AXK，X为菌数（cfu/ml）；A为菌落平均数；K=0.5。培养将上述营养琼脂培养基置于3035C下培养48小时，计数并记录结果。2.721.6试验组回收率（）=x100%试验组平均菌落数-供试品平均菌落数菌液组平均菌落数2

7、.7.2.1.7稀释剂对照组回收率（）=稀释剂对照组平均菌落数菌液组平均菌落数X%2.7.2.1.8可接受标准稀释剂对照组回收率鼻70%试验组回收率$70%重复上述操作，直至做完3次，结果见表2表4。霉菌及酵母菌计数方法的验证样品试验组取头抱卡品酯样品10g，加入200mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，充分振摇，混匀，作为1：20的供试液。取1:20供试液2ml和含50100cfu/ml白色念珠菌1ml,分别注入平皿中，立即倾注冷却至45C的玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿,进行培养计数。按上述方法同法处理黑曲霉。菌液组取试验用菌液1ml，分别注入平皿，立即倾注冷却至45

8、C玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，测定所加的试验菌数。供试品对照组取1：20供试液2ml注入平皿中，立即倾注冷却至45C的玫瑰红钠琼脂培养基，平行制备2个平皿，进行培养计数。培养将上述玫瑰红钠琼脂培养基置于2328C下培养72小时，计数并记录结果。2.2.5试验组回收率（）二试验组平均菌落数-供试品平均菌落数X100%菌液组平均菌落数可接受标准试验组回收率$70%重复上述操作，直至做完3次，结果见表5表7。2.7.2.3大肠埃希菌检测方法的验证样品试验组取头抱卡品酯样品10g，加入200mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，充分振摇，混匀，作为1：20的供试液。取1:20供

9、试液20ml，先以500转/分钟离心3分钟，取全部上清液过滤，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗三次，每次100ml，并在最后一次冲洗液中加入10100cfu/ml大肠埃希菌,滤干后取出滤膜，加入到100ml胆盐乳糖培养基，36C培养18-24小时，取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内继续培养，分别于5h、24h紫外灯下观察，观察后沿管壁加入数滴靛基质试剂，观察颜色变化。阴性对照组取1:20供试液20ml，先以500转/分钟离心3分钟，取全部上清液过滤，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗三次，每次100ml，并在最后一次冲洗液中加入10100cfu/ml金黄色

10、葡萄球菌，滤干后取出滤膜，加入到100ml胆盐乳糖培养基，36C培养18-24小时，取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内继续培养，分别于5h、24h紫外灯下观察，观察后沿管壁加入数滴靛基质试剂，观察颜色变化。可接受标准：试验组检出大肠埃希菌，阴性对照组未检出大肠埃希菌。测试结果重复上述操作，直至做完3次，结果见表8表10。检测的全过程必须严格遵守无菌操作，连续3批产品的验证试验结果均应表明，细菌计数方法验证的回收率均应$70%；霉菌及酵母菌计数方法验证的回收率均应$70%；大肠埃希菌检测方法验证中所有试验组均应检出大肠埃希菌，阴性对照组均不得检出大肠埃希菌。该产品的微生物

11、限度检查方法才可通过验证。表1实验用微生物的稀释和计数表2第一次批号为头孢卡品酯试验菌回收率验证结果菌种名称菌种编号稀释度接种量（ml）接种计数（CFU/ml）平均浓度（CFU/ml）金黄色匍萄球菌枯草芽抱杆菌大肠埃希菌白色念珠菌黑曲霉操作人/日期：复核人/日期：取1批生产样品，批号为（验菌的回收率见表2表4。），按2.2.1操作进行3次独立的平行试验，试试验菌菌数（cfu）皿1皿2平均回收率试验组稀释剂组金黄色葡萄球菌菌液组菌数试验组菌数供试品对照组菌数稀释剂对照组枯草芽抱杆菌菌液组菌数试验组菌数供试品对照组菌数稀释剂对照组大肠埃希菌菌液组菌数试验组菌数供试品对照组菌数稀释剂对照组操作人/日

12、期复核人/日期表3第二次批号为头孢卡品酯试验菌回收率验证结果试验菌菌数（cfu）皿1皿2平均回收率试验组稀释剂组金黄色葡萄球菌菌液组菌数试验组菌数供试品对照组菌数稀释剂对照组枯草芽抱杆菌菌液组菌数试验组菌数供试品对照组菌数稀释剂对照组大肠埃希菌菌液组菌数试验组菌数供试品对照组菌数稀释剂对照组操作人/日期复核人/日期表4第三次批号为头孢卡品酯试验菌回收率验证结果试验菌菌数（cfu）皿1皿2平均回收率试验组稀释剂组金黄色葡萄球菌菌液组菌数试验组菌数供试品对照组菌数稀释剂对照组枯草芽抱杆菌菌液组菌数试验组菌数供试品对照组菌数稀释剂对照组大肠埃希菌菌液组菌数试验组菌数供试品对照组菌数稀释剂对照组操作人

13、/日期复核人/日期），按2.2.2操作进行3次独立的平行试验，试取1批生产样品，批号为（验菌的回收率见表5表7。表5第一次批号为头孢卡品酯试验菌回收率验证结果试验菌菌数（cfu）皿1皿2平均回收率试验组稀释剂组白色念珠菌菌液组菌数试验组菌数供试品对照组菌数黑曲霉菌液组菌数试验组菌数供试品对照组菌数操作人/日期复核人/日期表6第二次批号为头孢卡品酯试验菌回收率验证结果试验菌菌数（cfu）皿1皿2平均回收率试验组稀释剂组白色念珠菌菌液组菌数试验组菌数供试品对照组菌数黑曲霉菌液组菌数试验组菌数供试品对照组菌数操作人/日期复核人/日期表7第三次批号为头孢卡品酯试验菌回收率验证结果试验菌菌数（cfu）皿

14、1皿2平均回收率试验组稀释剂组白色念珠菌菌液组菌数试验组菌数供试品对照组菌数黑曲霉菌液组菌数试验组菌数供试品对照组菌数操作人/日期复核人/日期由表2表4的结果可知金黄色葡萄球菌的回收率、枯草芽抱杆菌的回收率、大肠埃希菌的回收率均，均符合规定。说明头抱卡品酯采用离心沉集与薄膜过滤联合使用的方法能够有效消除头孢卡品酯的抑菌活性，并且采用离心沉集与薄膜过滤联合使用的方法不干扰细菌计数方法测定。由表5表7的结果可知白色念珠菌的回收率、黑曲霉的回收率均，均符合规定。说明头孢卡品酯采用离心沉集与薄膜过滤联合使用的方法能够有效消除头孢卡品酯的抑菌活性，并且采用离心沉集与薄膜过滤联合使用的方法不干扰霉菌及酵母

15、菌计数方法测定。取1批生产样品，批号为（），按2.2.3操作进行3次独立的平行试验，试验结果见表8表10。表8第一次批号为头孢卡品酯大肠埃希菌验证结果项目胆盐乳糖培养基MUG靛基质结论试验组检出未检出阴性对照组检出未检出操作人/日期复核人/日期表9第二次批号为头孢卡品酯大肠埃希菌验证结果项目胆盐乳糖培养基MUG靛基质结论试验组检出未检出阴性对照组检出未检出操作人/日期复核人/日期表10第三次批号为头孢卡品酯大肠埃希菌验证结果项目胆盐乳糖培养基MUG靛基质结论试验组检出未检出阴性对照组检出未检出操作人/日期复核人/日期由表8表10的结果可知,符合规定。说明头抱卡品酯采用离心沉集与薄膜过滤联合使用的方法能够有效消除头抱卡品酯的抑菌活性，并且采用离心沉集与薄膜过滤联合使用的方法不干扰控制菌的检验。2.9.1结论符合规定不符合规定备注：复核人：日期：漏项和偏差报告2.10.1.目的记录在头孢卡品酯微生物限度检查方法验证方案实施过程中发现的偏差和采取的解决办法。2.10.2操作对每一个出现的偏差，要确认解决方法和实施解决方法所需的步骤（如适用）。把由出现偏差而导致的变更控制表格附