微生物检测技术在基层突发公共卫生事件中的综合应用及分析课件

1、微生物检测技术在基层突发公共卫生事件中的综合应用及分析成都市CDC 黄薇2014年11月水和食品等的微生物污染是突发公共卫生事件中最大的危害及主要的致病因素60-70%由病原微生物引发，患病的人数约为化学引起疾病人数的两倍波及面大，发生频率高，常常造成较大的损失和危害而成为一个日益受到关注的公共卫生问题。 需要解决的问题生物or化学？可疑食物？样品采集？检测项目？检验方法？结果解释？突发事件之一流行病学调查家庭餐，4人共同进餐：米饭、回锅肉、皮蛋、炒素菜、白菜豆腐汤临床症状：第二天发病，均为呕吐、腹泻、水样便310次/天临床诊断为急性胃肠炎和急性细菌性痢疾2人未服药，2人已进行输液治疗抽丝剥茧

2、可疑食物比较明确生物or化学很明确 初步判断样品采集可疑食物：皮蛋2份（1份采自干杂铺的同一批皮蛋、1份为病人尚未食用的皮蛋） 病人样品：肛拭4份 、呕吐物1份 比较简单，易判断检测项目志贺菌沙门菌鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌检验方法常规检测PCR检测产物测序PFGE常规检测直划平板增菌培养时间接种平板挑选可疑菌落TSI几个？生化试验血清学试验PCR常规PCR：沙门菌的靶基因为InvA，产物长度为316bp，引物序列为：A1: 5-AACAGTGCTCGTTTACGACC-3，A2: 5-CCAGGCTATCGCCAATAAC-3 荧光PCR：试剂盒PCR产物测序：委托上海之江生物科技有限公司测定

3、 PFGE：中国CDC腹泻病室提供 编号样品名称HEMacTSI血清学试验生化试验(API20E)结论1病人肛拭光滑、湿润、微凸、1mm、中心黑色光滑、湿润、微凸、1mm、无色半透明-/+/A-F+，O4+O5+H多1+，Hi+，H2+,H5-4705552检出鼠伤寒沙门菌2病人肛拭光滑、湿润、微凸、1mm、中心黑色光滑、湿润、微凸、1mm、无色半透明-/+/A-F+，O4+O5+，H多价1+，Hi+，H2+,H5-4704752 检出鼠伤寒沙门菌3病人肛拭无可疑菌落无可疑菌落4病人肛拭无可疑菌落无可疑菌落5呕吐物未生长未生长6市售皮蛋光滑、湿润、微凸、1mm、中心黑色光滑、湿润、微凸、1mm

4、、无色半透明-/+/A-F+，O4+O5+，H多价1+，Hi+，H2+,H5-4704751 检出鼠伤寒沙门菌 7病家皮蛋未生长未生长常规PCR扩增结果M：marker；14：病人肛拭；5：病人呕吐物；6：市售皮蛋；7：皮蛋；8：德尔卑沙门菌（CMCC50719）；9：阴性对照荧光PCR-沙门菌扩增曲线1：德尔卑沙门菌（CMCC50719）；25：病人肛拭；6：呕吐物；7：市售皮蛋；8： 病家皮蛋 荧光PCR-志贺菌扩增曲线1：福氏志贺菌（CMCC51571）；2：阴性对照；其余为病人肛拭4份、呕吐物1份、皮蛋2份 测序结果扩增长度为300bp左右的产物测序结果经与Gen-Bank数据库中的序

5、列比对，其序列和沙门菌的同源性为99%扩增长度为1000bp左右的产物测序结果经与Gen-Bank数据库中的序列比对，其序列和大肠埃希菌的同源性为99%Spe I酶PFGE图谱M：Mark；12：病人肛拭分离株；3：市售皮蛋分离株 Xba I酶切PFGE图谱M：Mark；12：病人肛拭分离株；3：市售皮蛋分离株 用SpeI及XbaI酶切后的PFGE分型，两个病人肛拭及市售皮蛋中分离出的菌株帶型完全相同 3株不同来源的菌具高度同源性结果应用和分析3种方法在相同的两个病人肛拭中均检出沙门菌，培养法在市售皮蛋中亦检出沙门菌，但常规PCR及荧光PCR均未检出 常规PCR及荧光PCR均在10h增菌培养（

6、2h前增菌+8h选择性增菌）后进行，再经6h后得到常规PCR结果，4h后得到荧光PCR结果，培养法在增菌18 h后进行分离培养，5天后得到结果 检出限：常规PCR为105 Copies/ml，荧光PCR为103Copies/ml 应用常规PCR及荧光PCR检测病原菌时，病人粪便、肛拭等病源性检样的增菌时间在10h甚至可能可以更短，但食品、水等非病源样品的增菌时间应适当延长来源不同的3株菌生化反应不一致PCR产物测序及PFGE分型结果则表明污染了皮蛋的鼠伤寒沙门菌来源相同 很好地进行了溯源 PCR检测假阳性：核酸污染假阴性：菌量低或酶抑制物的存在实验室建设的规范实验室质量管理体系的建立自动化仪器

7、（荧光PCR仪等）的出现 方法的标准化成为可能美国农业部食品安全检疫署等国际官方检测机构已将PCR方法作为快速检测方法编写成实验室标准操作程序我国出入境检验检疫局也制定了用实时PCR法检测食品中致病菌的行业标准突发事件之二事件2010年9月成都市某乡镇中心卫生院及县第二人民医院发热患者个别患者有轻微腹泻均为当地9所学校在校学生 症状符合？第一次调查和处理根据初期症状和流行病学调查，实验室进行了呼吸道病毒的核酸检测，均为阴性 诊断为不明原因发热采取针对呼吸道传播疾病的控制措施后，疫情未得到有效控制，3天中发病范围继续扩大，发病人数快速增长 怎么办？第二次调查和处理进一步流行病学调查后，排除食物污

8、染途径，怀疑可能与供水污染有关采集样品：乡镇水厂、学校的自备水以及患者咽拭和肛拭确定项目：进行肠道病毒和细菌的检测 检测项目和方法常规法指标菌：总大肠菌群、大肠埃希氏菌水样细菌致病菌培养：水样和病人肛拭PCR法肠道病毒：诺瓦克病毒细菌：产毒素大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、副溶血弧菌） 样品名称 采集地点总大肠菌群大肠埃希氏菌肠道致病菌进厂水镇水厂12.41未检出出厂水镇水厂未检出未检出未检出自备水一小(32)200.52未检出管网水一小未检出未检出未检出管网水二小未检出未检出未检出自备水三小未检出未检出未检出管网水四小教学楼过道(71)200.5200.5未检出管网水五小学生宿舍(33)38.4

9、12.4未检出管网水镇中学(26)94.545.3未检出自备水镇中学洗碗处40.65.3未检出病人肛拭（9份）各医院宋内志贺菌10份水样指标菌检测结果为6份水样总大肠菌群和大肠埃希菌均超过生活饮用水卫生标准，提示水样已受到温血动物粪便污染常规培养则仅在患者肛拭中分离到宋内志贺菌 PCR检测-样品水样6份经抽滤富集未经增菌混合水样2份：1份为镇水厂出厂水、镇五小学生宿舍管网水、镇四小过道管网水混合，1份为镇一、二小管网水混合5份重点可疑水样8h增菌后肉汤患者肛拭4h增菌后1%氯化钠肉汤结果所有样品均未检出产毒素大肠埃希菌、沙门菌和副溶血弧菌混合水样和9例患者肛拭4h增菌液均为志贺菌阳性，镇水厂进

10、厂水、镇初级中学自备水为志贺菌阴性 5份重点可疑水样经1%氯化钠肉汤增菌8h后，再次检测志贺菌，均为阳性 水样未增菌与增菌后核酸检测Ct值比较 样品名称采集地点未增菌增菌8h进厂水镇水厂undet 17.07 出厂水镇水厂29.68 17.07 管网水四小教学楼过道29.68 23.5 管网水五小学生宿舍 29.68 16.27 自备水镇中学食堂洗碗处 undet 18.14 核酸检测结果显示在9份患者肛拭和5份水样中均检测到志贺菌核酸 该镇无论是水厂水源还是自备水源普遍受到志贺菌污染 指标菌、常规培养及核酸检测结果与各学校发病情况一致，表明此次暴发疫情是由宋内志贺菌污染饮用水引起的 实验室采用酶底物法和荧光PCR技术，在24h内即得到指标菌和致病菌的核酸检