新生大鼠心肌细胞的原代培养

1、新生大鼠心肌细胞的原代培养【摘要】目的：讨论新生大鼠心肌细胞的别离和培养方法。方法：应用0.0625%的胰蛋白酶重复消化出生第2d乳鼠的心肌组织屡次,搜集的细胞用含10%胎牛血清的de培养基中和，用差速贴壁别离法别离，在以溴脱氧尿嘧啶brdu纯化心肌细胞后置2培养箱孵育7d。结果：别离1只乳鼠获得的心肌细胞产量约为140万个，且有活力心肌细胞占90以上；培养46h的乳鼠心肌细胞开场贴壁生长,1224h明显增殖,34d后细胞交融成片；心肌细胞由圆形变为梭形、星形、多角形,并出现自发性节律性搏动。结论：本研究应用的心肌细胞原代培养方法可获得高产量、高活力的心肌细胞，是一种可靠的心肌细胞培养方法。【

2、关键词】心肌；细胞培养技术；大鼠priaryulturefnenaterattusardiyte/afang|fang，shenxia|li，linli|fang，hanli|li/hinesejurnalfardivasularrehabilitatinediine,2022，182:125authrsaddress：fujianprvinialhspital，fujianedialuniversity，fuzhu,fujian,350001，hinakeyrds：yardiu;ellulturetehniques;rat自1960年haray等1首次对乳鼠的心肌细胞进展培养以来，国内、外许

3、多学者对心肌细胞原代培养方法进展了研究。体外培养的心肌细胞可以保持其在体内原有的许多构造和功能，同时排除了神经、体液等因素的干扰，因此体外培养在心肌细胞的生长、发育、生理、代谢、病理等研究中具有重要意义。然而心肌细胞在别离过程中易受损伤,活细胞也很少分裂，且不易传代,因此进步心肌细胞产量和活力是许多学者研究的目的。本实验参照sipsnp等2心肌细胞的培养方法并作了改良，讨论了乳鼠心肌细胞培养的方法，对心肌细胞形态、搏动状况进展观察，并对其纯度进展了鉴定，从而获得高产量、高活力的心肌细胞。1资料与方法1.1材料实验动物：选择出生第2d的sd乳鼠,雌雄不拘由福建省医学科学研究所实验动物中心提供。主

4、要仪器与试剂:二氧化碳培养箱，lypus倒置显微镜,超净工作台，低速自动平衡离心机,恒温磁力搅拌器;de培养基(hyln公司)、胎牛血清(hyln公司)、胰蛋白酶(gib公司)、d-hanks液(hyln公司)、溴脱氧尿核苷(brdu，siga公司)、小鼠抗大鼠sarerieatin单抗(博士德公司)；山羊抗小鼠igg(博士德公司)。1.2方法1.2.1心肌细胞的别离:取第2d的sd乳鼠，无菌条件下开胸取心尖部，用预冷的d-hanks液洗涤3遍，将心脏剪成约13大小；用0.0625的胰酶在37恒温磁力搅拌器中消化心肌组织，消化过程中采用分次消化时间(5in5次,6in5次,7in5次,8in5

5、次)，第一次消化后自然沉淀并弃上清，以后自然沉淀后取上清；每次别离的上清液加等量含10胎牛血清的de培养液轻轻吹打制成细胞悬液，1000r/in离心10in，重复3次。1.2.2心肌细胞的培养:细胞悬液放2培养箱培养90in后，采用差速贴壁别离技术,吸收培养瓶中的细胞悬液，调整细胞浓度为5.0105细胞/l，将单细胞悬液接种于培养板中，前3d滴入brdu使其终浓度为0.1l/l，并继续培养；24h后换液,以后隔日换液。1.2.3心肌细胞搏动率的观察:在倒置显微镜下观察第1d至第7d心肌细胞的生长状态、形态变化，并摄像记录自发搏动频率。随机计数培养至第4d的心肌细胞的搏动率。细胞搏动率()=搏动

6、细胞数细胞总数100。1.2.4心肌细胞存活率的测定:取一样量的0.4台盼蓝液与细胞悬液混匀后再取适量混合液滴于细胞计数板上，随机取10个高倍20视野计数4个大格中的细胞总数及未染成蓝色的活细胞数，计数10次，取平均值。细胞存活率()=活细胞数细胞总数100.2结果2.1消化时间对心肌细胞活力和细胞产量的影响实验结果显示,采用0.0625%胰蛋白酶、37恒温低速磁力搅拌及分次消化时间为8in时心肌细胞活力和细胞总数较理想，见图1，图2。并且随着总消化时间的延长，细胞活力程下降趋势,见图3。2.2培养心肌细胞的形态特征培养46h后,在倒置显微镜下可观察到心肌细胞开场贴壁生长,初为圆形,后为梭形,

7、偶见单个细胞开场搏动,继而细胞逐渐在瓶壁外表铺展；随后细胞不断分裂、增殖,数量逐渐增多,形成不规那么的星形,细胞铺展状况更加明显,并伸出伪足；在培养第34d,伪足可互相接触交织成网,形成细胞单层或细胞簇,呈放射状排列的同心圆状,其搏动同步化,形成所谓功能性合体细胞，见图4图7见封三；至第4d自发搏动达顶峰，搏动率为8590；至第7d搏动率开场减少。2.3心肌细胞纯度的鉴定横纹肌肌动蛋白(a|atin)单克隆抗体作为一抗，用sab法进展免疫细胞化学染色，可见胞浆呈棕黄色染色；非心肌细胞染色呈阴性。结果显示几乎所有的细胞呈现阳性,说明此时培养的心肌细胞较纯，见图8见封三。3讨论心肌细胞培养能提供单

8、个细胞的同源性集落，在可视、可控制的环境中对心肌细胞的特性、药理、病理、生理、代谢和分子生物学等方面进展根底研究，具有产量大，重复性好及不受神经、体液因素影响的特点，已成为心血管研究的根本方法和手段之一，有着广阔的应用前景。由于各实验室所需要解决的问题、实验材料的取舍、实验室详细条件不同等,所采用的细胞培养方法也不尽一样。本研究采用0.0625%低浓度胰蛋白酶、37恒温低速磁力搅拌及短时间屡次消化的方法别离新生大鼠心肌组织,以获得高产量、高活力的心肌细胞。现对新生大鼠心肌细胞体外培养的影响因素进展总结,以进步心肌细胞培养的存活率。消化酶种类的选择：别离心肌细胞通常用的酶有胰蛋白酶和胶原酶3，也

9、有在胰蛋白酶或胶原酶中参加脱氧核糖核酸酶dnase4，目的是防止从损伤细胞中释放的dna积聚。而本实验室通过单独用胰蛋白酶消化得到较高质量的细胞，节省了实验本钱。消化酶浓度和消化时间的选择：新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感，因此消化酶的浓度和消化时间是实验成功的关键。不同的实验室采用胰酶的浓度从0.050.25不等，本实验室采用0.0625的胰蛋白酶浓度能获得高产量、高活力的心肌细胞。胰蛋白酶浓度过高时,心肌组织中细胞及间质均受到影响,极易把组织消化成为透明粘稠状液体,使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁才能及搏动才能；胰蛋白酶浓度过低时，心肌组织消化缺乏，细胞聚集成团，无法分清细胞边

10、界，难以进展形态学观测。不同实验室采用的分次消化时间从58in不等，我们在试验中发现分次消化时间为8in时，细胞产量和细胞活力较理想。有的实验室在心肌消化过程中将心肌消化到透明为止，而我们发现随着总消化时间的延长细胞活力呈下降趋势，本实验室将总的消化时间控制在20in左右。细胞培养过程中的无菌原那么：在进展细胞培养时,组织材料来源、培养液、血清、消化酶、手术器械、培养板等,要严格按无菌实验要求准备,培养过程中详细操作的每一步都应严格遵循实验原那么和无菌要求。心肌细胞的观察、拍照时间不可过长，频率不可太高，否那么能增加污染概率。心肌细胞生长适宜的ph值：心肌细胞生长的最适ph值为7.27.4，因

11、此培养液、胰蛋白酶、d-hanks液ph值均应在此范围内。当ph低于6.8时,对心肌细胞生长会有抑制作用；当ph值大于7.6时，心肌细胞生长亦会受到抑制，且搏动会减弱。成纤维细胞对心肌细胞培养的影响：细胞培养中的非心肌细胞主要是成纤维细胞，成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖才能，大量成纤维细胞的存在不仅限制心肌细胞的活动,而且其分泌物也影响心肌细胞的形态构造和生理功能5。本实验采用90in差速贴壁和brdu可得到较纯的心肌细胞。brdu可显著抑制心肌细胞中的成纤维细胞,并发现brdu对心肌细胞无毒性与抑制作用,可使培养细胞中心肌细胞所占比例从4550进步到85906。心肌细胞的接种密

12、度：心肌细胞的接种密度不仅影响别离细胞的分化表型特征,而且影响心肌细胞的生存时间。心肌细胞之间联络可促进细胞自发活动的形成。假如心肌细胞接种密度太低,细胞间难进展信息交流,细胞生长不良、细胞难于生存；假如细胞密度太高,那么易发生营养不良，且许多细胞难于贴壁生长,在更换培养液时容易被丧失7。本实验室的心肌细胞接种密度一般为5105细胞/l,此时细胞生长良好,收缩明显而有力,搏动频率多在70120次/in。综上所述，心肌细胞增殖才能低，大多实验来源于心肌细胞的原代培养，因此原代培养的成功与否直接关系到实验的进程，而进步心肌细胞的产量和活力是心肌细胞培养成功的关键。本研究介绍的心肌细胞原代培养方法，

13、细胞贴壁快、搏动早、产量高，活力好而且操作简便、本钱低，是一种较为理想的心肌细胞原代培养方法。【参考文献】1hararyl，farlyb.invitrstudiesfsingleislatedbeatingheartellsj.siene,1960，131:1674-1675.2sipsnp，savins.differentiatinfratyytesinsingleellulturesithandithutprliferatingnnyardialellsj.irares，1982，50：101-106.3suzukit，hta，hshh.serufree，heiallydefinededi

14、utevaluatethedireteffetsfgrthfatrsandinhibitrsnprliferatinandfuntinfnenatalratardiausleellsinulturej.invitr，1989，25：601-606.4bera，vandereesg，ndergej，etal.separatinfnenatalratventriularyytesandnn|yytesbyentrifugalelutriatinj.eurj，phy，2002，444(3)：452-456.5iragli，gaudesiusg，rhrs.eletrtnidulatinfardiaipulsendutinbyyfibrblastsj.irares，2022，98(6)：801-810.6sunh，hartierd，leblann，raellularaliuh