发酵工程种子的扩大培养详解课件

1、发酵工程 课件 Fermentation Engineering第2章 菌种种子的扩大培养欢迎光临主讲人：程云清7/26/20221长江大学生科院生物工程系 教学目的：了解种子扩大培养的目的和制备过程；掌握优良种子应具备的条件；掌握种子制备技术；了解谷氨酸和青霉素生产的种子制备。 教学重点、难点：发酵级数的确定及对发酵的影响；接种量的确定及对发酵的影响；影响种子质量的因素及其控制措施。第四节 种子的扩大培养（2学时）7/26/20222种子的扩大培养1制备过程2实验室阶段3生产车间阶段4种子质量控制 内 容 速 览7/26/20223种子扩大培养的目的: 接种量的需要 缩短发酵时间、提高发酵效

2、率 需要数量多、代谢旺盛、活力强的种子接入发酵罐中。 菌种的驯化一 种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的概念: 种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。7/26/20224优良种子应具备的条件： 菌体浓度及总量能满足大规模发酵罐接种量的要求； 生理状态稳定，如菌丝形态、菌丝生长速率等； 生长活力强，移种至发酵罐后，能够迅速生长； 无杂菌污染，保证纯种发酵； 菌种适应性强，能保持稳定的生产能力。 返回7/26/20225二 种子制备技术概要（一）种子制备的过

3、程 1砂土孢子 2冷冻干燥孢子 3斜面孢子 4摇瓶液体培养 5茄子瓶斜面培养 6固体培养基培养 7、8种子罐培养 9发酵罐 返回7/26/20226（二）实验室阶段1、培养物选择的原则 目的：种子扩培到一定的量和质。 根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此形象地将这些培养过程称为实验室阶段。7/26/20227 对于不产孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。 三角瓶摇床培养7/26/20228 对于产孢子的微生物 获得一定数量和质量的菌丝体

4、： 对于产孢子能力不 强及孢子发芽慢的菌种，可以采用摇瓶液体培养法，经恒温振荡培养获得菌丝体。 获得一定数量和质量的孢子： 对于产孢子能力 强及孢子发芽、生长迅速的菌种可采用固体培养基培养孢子，所获孢子可直接作为种子罐的种子。7/26/20229孢子的制备 细菌孢子的制备 斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。 培养温度：一般为37C，少数28C 。 培养时间：需要510天。 霉菌孢子的制备 一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。 培养的温度：一般为2528C。 培养时间：414天。7/26/202210 放线菌孢子的制备 一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适 合产

5、孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白 胨和一些无机盐等，C、N不要太丰富（碳源约为 1%，氮源不超过0.5%） 。 培养温度：大多数为28C，少数37C 。 培养时间：514天。7/26/202211 原始菌种 斜面试管 获得孢子 250ml 茄子瓶（大米或小米） 25 28 ，414天 成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4 冰箱保存）。e.g 产黄青霉菌7/26/202212对于不产孢子的赤霉素生产菌（Gibberelline fujikuroi），也可用大米固体培养基在茄子瓶中培养菌丝体，用作种子罐种子。 不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状杆菌（Corynebacteri

6、um）、短杆菌（Brevibacterium），生产上一般采用斜面营养细胞进行扩培，再转入液体摇瓶培养，获得细胞悬液再接种。7/26/202213 e.g. Glutamic acid-producer：（谷氨酸生产菌）原始菌种（出发菌种） 固体试管斜面（32 C ，1824小时） 三角瓶培养（摇床）(flask culture) 种子罐培养 e.g. yeast：原始菌种（出发菌种） 10ml 麦汁试管 250ml 三角瓶培养 （27 C 28 C ，3天） （25C， 2天） 510 L卡氏罐（15 C 20 C ，35天）7/26/2022142、培养基选择的原则 培养基的选择应该是有利

7、于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。 在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。 返回7/26/202215（三）生产车间阶段1、培养物的选择原则 在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。菌丝体比孢子要有利： 缩短发酵时间有利于获得好的发酵结果 生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，在工厂一般归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。7/26/2022162、培养基选择的原则目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。

8、在原料方面： 不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因: 一是成本、二是驯化。7/26/2022173、发酵级数的确定谷氨酸：三级发酵一级种子（摇瓶）二级种子 （小罐）发酵青霉素：三级发酵（二级种子罐扩大培养）一级种子 （小罐）二级种子（中罐）发酵 一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。7/26/2022187/26/202219发酵级数确定的依据： 级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响； 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般24级； 在发酵产品的生产中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面。7/26/202

9、220采用三级种子的谷氨酸发酵工艺 李文东， 发酵科技通讯，2003,7斜面一级种子（1200ml/5000ml三角瓶）二级种子（2m3） 三级种子（20m3)发酵罐（240m3) 背景：近年来，由于谷氨酸发酵产酸水平快速提高，发酵工艺也在不断改进和创新，国内大多数厂家都采用“大种量二级种子发酵工艺”（种子罐是发酵罐的5%以上） ，发酵产酸水平和糖酸转化率比“小种量二级种子发酵工艺”（种子罐是发酵罐的1%左右）有了较大提高。但是生产水平和糖酸转化率稳定性较差，发酵平均周期35h左右，没有达到提高设备利用率和降低生产成本的目的。文章：三级种子工艺7/26/202221 种量更大，生长速度更快，产

10、酸提前且速度快：工艺8小时产酸（%）12小时产酸（%）发酵周期（h)三级种子2.22.74.65.232大种量二级种子1.01.52.63.435 糖酸转化率高且稳定工艺产酸（%）糖酸转化率（%）单罐产量(吨）三级种子10.9359.821二级种子9.85818三级种子的特点：7/26/2022224、接种量的确定接种量指移入种子液的体积和接种后培养液体积之比。接种量大小取决于生产菌种的生长繁殖速度。过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为715%，而由北京棒状杆菌发酵谷氨酸只需1%。 7/26/202223一般认为大一点好。采用较大的接种量可缩短菌丝体繁殖达到高峰的时间，使产物形成提前

11、到来；生产菌占优势，减少杂菌生长的机会。接种量过多，往往又会使菌丝生长过快，培养液黏度增加，造成溶解氧不足，而影响产物的合成。接种量过小，引起发酵前期菌体生长缓慢，使发酵周期延长，菌丝量少，产生菌丝团，导致发酵异常等4、接种量的确定7/26/202224 近年来，生产多以加大种子量及采用丰富培养基作为获得高产的措施。 有的产品采用双种法：两个种子罐接种到一个发酵罐中，如卡那霉素生产中采用双种比单种的发酵单位提高8%；也有的采用倒种法：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐中发酵液，如链霉素发酵中，使用倒种比单种发酵单位提高12%。 4、接种量的确定7/26/202225接种量对菌体形态和产

12、亚麻酸的影响 杨博， 中国油脂，2002 亚麻酸是一种人体必需多价不饱和脂肪酸，它是人体前列腺素的前体物质，在预防与治疗心脑血管疾病、糖尿病治疗、增强免疫力、抗癌和保护皮肤等方面具有重要的生理功能。因发酵法生产亚麻酸与从天然植物提取相比具有一系列优点，发酵法生产亚麻酸成了当今研究的一个热点。 亚麻酸发酵一般是采用丝状真菌来进行，丝状真菌的形态往往对发酵有较明显的影响，而丝状真菌发酵亚麻酸时菌丝体形态的不同对发酵的影响很少有报道。7/26/202226采用被孢霉进行亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体7/26/202228本研究发现，采用被孢霉进行亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体的形态，从而

13、影响菌体干重和亚麻酸产量。种子的扩大培养7/26/2022295、种龄(seed age) 种龄是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 种龄年轻：接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、整个发酵周期延长、产物开始形成的时间推迟，甚至出现发酵异常情况； 种龄过老：引起生产能力下降而菌丝过早自溶。 原则：一般以处于对数生长期的菌丝体较为合适，细胞活力强，菌体浓度相对较大。具体需实验确定。7/26/202230舒琴， 林产化学与工业，2004 菌种为嗜碱性芽孢杆菌 镜检：24小时多个杆菌首位相连成线形，处于繁殖 旺盛期，30小时开始出现芽孢 返回7/26/202231（四）

14、种子质量控制1、种子质量标准2、影响种子质量的因素3、种子质量的控制措施、种子质量异常分析7/26/202232生化指标检查菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色泽、气味、浑浊度等）检查有无杂菌污染产物生成量其他参数1、种子质量标准7/26/202233检测培养液中的糖氨基氮磷酸盐含量:萃取-磷钼蓝比色法 pH值生化指标3，5-二硝基水杨酸法斐林试剂法7/26/202234色泽、气味、浑浊度等单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态；霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。 检查菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观7/26/202235

15、缬霉素发酵液中氨基氮的测定氨基酸中的-NH3+基的pk值常在9.0以上，不能用一般的酸碱指示剂（包括酚酞），以氢氧化钠溶液作滴定测量。但可以用甲醛滴定法测量。在pH中性和常温条件下，甲醛迅速与氨基酸中氨基相互作用，使滴定终点移至pH9.0左右，在该过程中指示剂酚酞不与甲醛作用。pH9.0正是酚酞的变色范围，因此，可以用酚酞作为指示剂，以氢氧化钠溶液来滴定-NH3+基上的H+，每释放一个氢离子，就相当于一个氨基酸。7/26/202236反应如下 R-NH3+ H+R-NH2R-NH2+2CH3CHO R-N(CH2OH)27/26/202237实验步骤1.将发酵液过滤，取滤液2.5mL于 250

16、mL三角瓶中，加蒸馏水约50mL,加甲基红指示剂23滴，加1mol/LHCl溶液12滴，使成红色，放置3min.2.以标准NaOH溶液滴定至刚好转橙黄色，读取此时滴定管刻度，加入12中性甲醛10mL，放置510min。3.加入酚酞指示剂1mL，用标准NaOH溶液滴定至呈微红色为终点，读取此时滴定管刻度。两次读数之差即为所耗NaOH毫升数。7/26/202238结果计算 NNaOHVNaOH 14.01NH-N%= 100 2.5单位：mg/100ml 7/26/202239产物生成量如，在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟

17、程度。其他参数：如某些酶的活力、种子罐的溶氧和尾气等。 eg,土霉素生产的种子液中的淀粉酶活力与土霉素发酵单位有一定的关系。 检查有无杂菌污染7/26/202240产物生成量如，在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。其他参数：如某些酶的活力、种子罐的溶氧和尾气等。 eg,土霉素生产的种子液中的淀粉酶活力与土霉素发酵单位有一定的关系。 检查有无杂菌污染7/26/2022412、影响种子质量的因素原材料质量 种龄 培养条件斜面冷藏时间2、影响种子质量的因素7/26/2022422、影响种子质量的因素 生产过程中经常会出现种

18、子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动：产地、品种、加工方法等。 e.g1：四环素、土霉素斜面用麸皮：小麦产地、品种、加工方法及用量影响孢子的质量。 e.g2：蛋白胨：有鱼胨、骨胨、胰蛋白胨。琼脂、水 无机离子差别引起孢子质量变化，微量Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成。原材料质量7/26/2022432、影响种子质量的因素 种龄 种龄过于年轻的种子接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、泡沫多、发酵周期延长以及因菌体量过少而菌丝结团，引起异常发酵等等； 种龄过老的种子接入发酵罐后，则会因菌体老化而导致生产能力衰退。一般以对数生长期为好。 7/26/202244 培养条件 培养

19、温度过低会导致菌种生长发育缓慢，过高会使菌种过早自溶。如果不是用最适温度培养，其生产能力就会下降。 选择最适种子培养pH；最后一级种子的培养基pH应接近于发酵培养基的pH，以便种子能尽快适应新的环境。 通气与搅拌（aeration and agitation 足够的通气量可提高种子质量；搅拌可以提高通气效果，如果搅拌效果不好、搅拌时泡沫过多会使菌丝黏壁，甚至菌丝结团，影响种子质量。此外，丝状真菌，一般不宜剧烈搅拌。2、影响种子质量的因素7/26/202245湿度：斜面培养基的湿度对孢子的质量有较大影响，湿度低孢子生长快，湿度高孢子生长慢。在南方相对湿度控制在3542。孢子数量最多，孢子颜色均匀

20、，质量较好。 如土霉素生产菌种龟裂霉菌的孢子，在北方干燥地区孢子斜面长的快，在含少量水分的试管斜面培养基中下部孢子长的好，而上部孢子稀少；气温高，湿度大的地区，斜面孢子长的慢，试管下部冷凝水多而不利于孢子形成。 培养条件7/26/202246 对孢子的生产能力有较大的影响，通常冷藏时间越长，生产能力下降越多。土霉素菌种孢子斜面培养四天左右，即于4冰箱保存，发现冷藏78天菌体自溶，而培养五天以后冷藏，20天未发现自溶。链霉素发酵中，斜面孢子在6冷藏2个月后发酵单位比冷藏1个月的降低18% 。斜面冷藏时间7/26/2022473、种子质量的控制措施 种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的

21、生产能力，所以必须保证：菌种的稳定性；提供种子培养的适宜环境；无杂菌侵入。（1）菌种稳定性的检查 定期考查和挑选菌种，对其进行自然分离，摇瓶发酵，测定生产能力，以不低于原有的生产能力为原则，从中挑选出高产菌株，并及时对退化菌种进行复壮。7/26/202248 确保菌种能在适宜的条件下生长繁殖，包括营养丰富的培养基、适宜的培养温度、pH和湿度、合理的通气量等。（3）种子无杂菌检查 种子在制备过程中每一步移种均需进行无杂菌检查，并对种子液进行生化分析：主要是取样测定其营养消耗速度、pH变化、溶解氧利用情况、色泽和气味等。 无菌检查是判断杂菌的主要依据，通常采用镜检和无菌试验相结合。（2）适宜的生长

22、环境7/26/202249、种子质量异常分析菌种生长过慢或过快：与孢子质量及种子罐的培养条件有关。通入种子罐的无菌空气的温度较低或者培养基的灭菌质量较差是种子生长、代谢缓慢的主要原因。 菌丝结团：与搅拌效果差，接种量小有关。菌丝结团会影响菌的呼吸和对营养物质的吸收。 菌丝粘壁：与搅拌效果不好，泡沫过多，以及种子罐装料系数过小等原因有关。其结果使培养液中菌丝浓度减少，最后就可能形成菌丝团。 返回7/26/202250三 种子制备过程举例（一）谷氨酸生产的种子制备制备过程斜面种子摇瓶种子（一级种子）种子罐种子（二级种子）发酵7/26/2022511、斜面种子培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5% 琼脂 2%， pH 7.0-7.2培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细。培养条件：32，生长18-24小时。 生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传 代不超过3次。7/26/2022522. 一级种子（摇瓶种子）培养条件：于10