细胞免疫荧光实验步骤

1、细胞免疫荧光实验步骤细胞免疫荧光实验步骤简单实验步骤如下:1漂洗血清蛋白2度4P小2寸2度甲醇固定20分钟后自然、干燥10分钟洗净3mir31rir25mir酉3成50lrir5mlp洗净汰5mir羊血清封闭：37度，20分钟抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度12小时4度洗净，3mir*5次9二抗37度小于一小时037度洗净，3*5mir凉干封片（封闭液PH85）活细胞免疫荧光技术流式细胞仪标本的制备（一）制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）!用10%调整细胞浓度为5X1061X107/ml!取40pl细胞悬液加入预先有特异性55pl的小

2、玻璃管或塑料离心管，再加50pl1:20（用稀释）灭活正常兔血清（4C30mir用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpmX5mir!弃上清，加入50p工作浓度的羊抗鼠（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇4C30min用洗涤液洗涤次，每次加液m左右1000rpmX5min!加适量固定液（如为制备标本，一般加入1m固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100500固定液!检测或制片后荧光显微镜下观察（标本在试管中可保存5天（二）试剂和器材各种特异性单克隆抗体。荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。10%SP140,洗涤液、固定液（见附录。玻璃管、塑料管、离心机、荧

3、光显微镜等。（三）注意事项整个操作在4C下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白受体，降低和防止非特异性染色。细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。附:DPBS(X10,贮存液蒸馏水加至1000P411临用时用蒸馏水1：10稀释HP4洗涤液DPBS900mlS0终浓度4%30终浓度0%固定液DPBS1000ml葡萄糖20g终（浓度2%）甲醛10ml0终浓度00%4.玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。（三）注意事项1

4、整个操作在4T下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的3，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白受体，降低和防止非特异性染色。4.细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。附:1PBS（X10,贮存液NaCl80g蒸馏水加至1000apo11临用时用蒸馏水1：10稀释KH2PO4洗涤液PBSS终浓度%4%Na3N终浓度%固定液DPBS1葡萄糖终浓度%甲醛1Na3N终浓度%严重同意楼上的讲解。我是做流式细胞分析的间接荧光，图简单加一抗后只洗涤一次，二抗后没有洗涤，就

5、直接加另外一个抗体，结果做了好多次就是呈阴性反应！排除了好久才多洗涤了两次，结果很是令人满意。我想请问楼上：3哪里有卖？谢谢！我找过，发现它是一种化学工业产品，成桶成桶的卖，而且有剧毒啊！是不是不是同一种东东？我做的是的1免疫荧光，步骤如下：I、细胞在盖片上生长融合到95100时，从孵箱中取出2用预温的1XPBS洗次，每次1分钟3、4的甲醛室温固定2030分钟1XPBS洗次，每次1分钟%1透化一分钟1XPBS洗次，每次1分钟BS1A温封闭分钟8加一抗（用1%BS稀释）放在湿盒里，度过夜1XPBS洗次，每次1分钟1o加二抗（用1%BS稀释）分钟，闭光！II、1XPBS洗次，每次1分钟12、9%5

6、甘油封片注：甲醛，BS均用1XPBS稀释从大鼠分离的细胞能否直接做细胞免疫荧光我做的大部分细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：取出细胞爬片放到或用过的细胞培养皿里，洗三遍。注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加，稍晃一下就倒掉，没有等分钟或分钟。%冷的多聚甲醛固定分钟，洗三遍。0通透分钟，洗三遍。与二抗相同宿主的血清封闭分钟，洗三遍。一抗度湿盒内过夜，也可度小时，感觉前者效果好，洗三遍。二抗室温小时（避光），或者度半小时，洗三遍。最好用染核，然后直接照荧光片。蒸馏水洗掉，

7、甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。建议：1二还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。2二荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3二二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。我要做的是，可是效果不是很好，可以用甲醇固定吗，和甲醛比那个合适各位同仁:我现在急于做人乳腺癌细胞的免疫荧光实验，目的是测凋亡时，基因的-蛋2白表达变化。不知道怎么选一抗和二抗试剂盒。请高手指教。万分感谢！能发一个邮件更好，再一次感谢！我的：抗淬灭剂可拿来直接封片,2微0升即可.之后片子可保留更长时间不是原创我是做悬浮细胞的，是人单核细胞系，主要问题是悬浮细胞在洗涤以及孵育次数多了会越洗越少，请问各位怎么洗法细胞不会变少。（离心转速比较重要，还有有人说离心后上清不用移液器吸，直接倒比较好，我也试过，可还是越来越少）顶一下我也遇到了同样的问题，不知