基因工程工具酶课件

1、基因工程常用工具酶限 制 性 内 切 酶DNA 连 接 酶DNA 聚 合 酶修 饰 酶限制性内切酶1、发现历史2、分类和命名3、型核酸内切酶基本特征4、酶切反应要点5、双酶切的技巧核酸酶的分类 内切酶 非专一性 外切酶 核酸酶 内切酶 RNA 外切酶 专一性 非限制性 内切酶 限制性 DNA 外切酶 限制性内切酶的类型基因工程中最常用的是型酶型酶的命名、书写规则1、 前三个字母用 斜体，其他用 正体 表示。2、前三个字母来自于产生该酶的微生物的 拉丁名，其中，第1个为属名的第一个字母，后两个为种名的前两个字母。3、如果酶存在于一种特殊菌株中，三个字母后加上菌株名称符号；4、名称最后部分往往包含

2、罗马数字,表示在该特殊菌株中发现这种酶的先后次序。（示例） 限制酶 来源 剪切方式Eco R I Escherichia coli RY 13 GAATTCPst I Providencia stuartii 164 CTGCAG型核酸内切酶基本特征1、每一种酶都有各自特异的识别序列。 (1) 序列不同 (2) 长度不同：47 bp (3) 但与DNA来源无关2、识别序列一般具有回文结构。 5 GA A T T C 3 3 C T T A AG 53. 切割后, 产物 的特点 （1） 5pi, 3OH （2） 平端 粘端 都是 5 突出 或 都是 3 突出 （3） 粘端可重新通过氢键配对4.

3、特殊性质 Eco R1切割型核酸内切酶的特殊性质1、同位酶： 识别相同序列，但切割位点不一样的酶 ( 如Sma I 和 Xma I )2、同尾酶: 识别位点不同，但切割出相同的末端序列 （Bam H I 和 Bcl I)；3、同裂酶： 识别位点和切割位点都相同的酶（Hpa I 和 Hin c )；4、甲基化的调节： Msp I (所有）和Hpa (非甲基化）5、Star 活性 （星号活性）： 在非标准反应条件下,也能切割一些与其特异识别序列类似的序列。在酶的名称右上角加一个星号(*)表示,如EcoR*。6、位置效应 酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同（侧翼序列太短无法切）酶切反

4、应要点1.温度: 一般37C, 特殊25C( Sma I)2. 对Na+要求不一样分成3类: 【低盐（ 0) 】 【 中盐（50 mM】【高盐（100mM)】3、尽量使反应体积最小, 但 酶的用量不超过总体积的 10% (甘油抑制酶活)4.决不能用水稀释,以免变性失活。5.先配好其它试剂，最后才加酶；6. 取酶立即放于冰上，用完后立即放入20C。7. 使用无菌的新枪头。双酶切的技巧1、两种酶buf 不一样 (1) 选通用buf (2) 先用(低盐buf+E低)反应, 后补高盐buf+E高反应； 2.两种酶反应温度不一样： （1）先(E1+T1)反应 , 后 （E2T2）反应； 3. E1结果影

5、响E2反应： (1)先加E2反应, 后加E1反应连接酶 (DNA ligase)1. 作用原理2 用途3.操作要点连接酶的作用原理在E.coli和动植物细胞中都有此酶。能催化DNA 中相邻的3-OH和5-P之间形成磷酸二脂键。Function of T4 DNA ligase(1)能封闭DNA双链或RNA/DNA杂种双链中的单链缺口，而不能封闭双链RNA中的单链缺口(2)能封闭粘性末端退火后出现的缺口；用途：(1)通过粘端连接DNA分子；(2)连接平端双链DNA分子或平端DNA与人工接头的连接。连接酶操作要点T：多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15以下,然而保持连接酶活性的最适温度却是37,

6、 因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷。经常采用16（4-16）。DNA concentrations：外源片段浓度比载体DNA浓度高10-20倍防止环化：碱性磷酸酶预先处理质粒载体Time:O/N better平端连接:加大酶量DNA聚合酶Taq 酶Klenow 酶反转录酶末端转移酶Taq 酶耐热DNA聚合酶: 94 能较长时间保持活性, 最适温度72 ;方向:53底物: 模板+引物+dNTP (还需Mg2+ )反应速度: 1 kb / min不同种类的 Taq 酶功能不同.用途: (1) PCR (2) sequence (3) TA cloneKlenow 酶特点:DNA

7、聚合酶的C-端大片段( 被枯草杆菌蛋白酶切割)MW76kD53聚合酶活性(合成)4. 3 5外切酶活性(矫正)用途:DNA探针的标记2. 平端化: 补平3凹端或切除3凸端反转录酶(reverse transcriptase)两种: AMV (来源于鸟类肿瘤病毒)- 42 反应 M. M L V (来源于鼠白血病毒)-37反应主要特点: (1) RNA DNA （） (2) DNA DNA (3) 外切RNA (4) 不具有 纠错功能用途： (1) mRNA转录成cDNA (2) 以ssDNA或RNA为模板合成杂交探针 末端转移酶(terminal transferase)1. 取自小牛胸腺2.

8、 催化脱氧核苷酸与DNA的3-OH结合 引物或底物是带有3-OH基的ssDNA或带有突出的双链DNA。不要求模板。3.两种反应： Mn2+ 或Mg2+ ssDNAOH+ndNTP DNA-(pdN)n+nppi Co2+ dsDNAOH+ndNTP DNA- (pdN)n+nppi4、用途： 加一个同源多聚物，便于未知序列的操作。修饰酶1、T4多核苷酸激酶2、碱性磷酸化酶3、核酸酶 (1) 核酸酶 Bal 31 (2) 核酸外切酶 (3) 单链核酸酶S14、DNA甲基化化酶 T4多核苷酸激酶(Kinase)作用原理： 催化ATP的 Pi转移到DNA或RNA的5-OH,使之磷酸化。用途： 放射性

9、标记 DNA链的5末端，探针标记注意： （1）铵离子是该酶的强烈抑制剂,处理前,DNA不能溶解于含铵盐的缓冲液中。 （2）低浓度的磷酸也可抑制该酶活性。 （3）该酶很难纯化,酶制品经常不纯。碱性磷酸化酶作用原理：切除DNA、RNA、rNTP和dNTP上的5磷酸基团 ,变成5 OH。来源： （1）细菌碱性磷酸酶(BAP)：BAP活性更高, 对热和去污剂抗性更强,因此脱磷酸化后很难完全抑制BAP活性。 （2） 牛小肠碱性磷酸酶(CIP)： 除去CIP可用蛋白酶K降解用途： （1）从DNA片段上除去5磷酸以防自身连接。 （2）在放射性标记DNA 5末端前，除去磷酸。 核酸酶 Bal 31具两种活性：

10、(1)双链特异外切酶活性；从dsDNA的3和5切除寡核苷酸或单核苷酸；EGTA(乙二胺四乙酸) 可终止反应(2)单链特异内切酶活性：专门从单链DNA切除带有5末端的单链核苷酸和寡核苷酸(类似于核酸酶S1的单链特异性核酸内切酶活性) Ca2+ Ca2+ Ca2+ 用途：1.切除dsDNA的末端核苷酸，使DNA的分子变小，在T4连接酶的作用下连接接头和载体。2.绘制DNA的限制图谱。 Bal31与限制性内切酶协同作用可绘制物 理图谱.还可逐步缩短DNA片断，使之适合构建嵌合质粒。Bal31de 内切酶活性已用于检测致癌剂与突变剂引起的DNA双链损伤核酸外切酶 (Exonuclease ) 活性：(1) 3外切酶； Mg2+(2)3磷酸酶,内切酶和 RNase H 活性用途： (1)制备DNA聚合酶的模板； (2)制备特异性探针。 Exo R酶切位点 DNA pol 32P dNTP 限制性酶(3)从DNA末端内切S