细胞膜色谱法及其在中药筛选研究中的应用-药物分析园地-西安交通

1、细胞膜色谱法及其在中药筛选研究中的应用贺浪冲，杨广德，梁明金，王嗣岑（西安交通大学，西安 710061）贺浪冲等创立了一种新的生物亲合色谱方法一细胞膜色谱法（Cell MembraneChromatography, CMC） 1, 2,多年来对其基础理论、实验方法和应用价值进行了 系统、深入地研究3, 4,并不断完善和提高。已经成为继经典放射性配体方法之 后，又一种新的受体药理学实验研究方法， 并成功地用于对中药复杂体系中物质 基础的筛选研究。从1996年起，已将高通量色谱分离制备技术和受体细胞膜色 谱筛选技术用于中药复杂体系中药效物质筛选与研究之中。通过对123种中药材、60种陕西秦巴山区药

2、用植物进行了快速有效的筛选，已发现 12种中药材和 8种植物中的36个有效成分对血管内皮细胞、心肌细胞上的钙通道受体、大脑 细胞上的B受体、胰岛B-细胞和A细胞等均具有不同程度的作用活性，并建立起 了部分中药和药用植物的样品库和活性库。 对这些活性部位和成分作了进一步的 离体和整体药理实验研究，发现药理结果与模型筛选结果有良好的相关性。 一、细胞膜色谱法及其特性1.细胞膜色谱柱的制备2, 31）膜制备 组织块称重，加入10倍体积的Tris-HCL缓冲液，冰浴下匀浆、 过滤，10000g离心10min,沉淀用缓冲液混匀，离心2-3次，用10mmol Tris-HCl 和2mmol LiBr提取4

3、5min, 1000g离心10min ,得均匀的细胞膜悬液，用Lowrry 法测蛋白含量。2）色谱柱的制备 制细胞膜的吸附等温线，计算硅胶饱和吸附量 制备相应 膜固定相的初始细胞膜浓度。取活化硅胶 20mg,加入膜制备，在4度摇床上震 荡60min,平衡后离心分离，沉淀物用0.6mL的Tris-HCl洗涤，用低压湿法加入 12mmx 50mm ID的不锈钢色谱柱中，将细胞膜固定于硅胶载体表面。在柱温37 C, pH=7.4的磷酸盐缓冲液平衡一段时间后准备进样分析。通过扫描电镜和 能谱法研究已证实细胞膜能完全覆盖硅胶表面， 不存在与硅胶的非特异结合；制 成的细胞膜固定相（CMSP）在几天内可保持

4、受体蛋白的立体结构和生物活性。为 了保证细胞膜色谱柱的生物稳定性，一般实验可在1天内完成。通过扫描电镜和 能谱法研究已证实细胞膜能完全覆盖硅胶表面，不存在与硅胶的非特异结合。由CMC模型构成的色谱系统，实验证明：经扫描电镜分析和表面能谱分 析，CMSP表面完全被细胞膜所覆盖。CMSP表现出普通细胞膜制剂所具有的 酶活性特性，活性在比液载体内稳定。由 CMSP构成的CMC系统与通常的正 相色谱和反相色谱系统不同，是一种特殊的生物色谱体系。 CMC系统具有生 物活性和色谱分离双重特性。与经典靶体 -配体结合实验（RBA,受体功能分 析法）比较，CMC法具有同样的生物亲和特性180药物分子与膜受体亲

5、和力研究在此色谱系统中，药物分子与细胞膜及膜受体的作用是多样的。自然生物 膜存在有多种活性蛋白，药物分子可能与多种受体或通道蛋白结合， 具容量因 子（K）可反映药物分子与细胞膜上多种受体的协同结合效应；用容量因子反 映药物分子亲和力，既包括特异结合，也包括非特异结合；保留作用的大小除 了与药物分子亲和力大小有关外，可能还受其他因素如化合物极性的大小的影 响，因此，必须先用药物与受体饱和结合后，才能测得其特异结合。与 RBA 技术相似，CMC技术也可进行配体-受体竞争性结合研究。CMC模型的技术特点1）具有特异性、饱和性、可逆性和竞争性结合等特点根据候选小分子化合物溶液在色谱柱内保留特性 ，细胞

6、膜生物亲和色谱实 质反映了小分子化合物分子与膜受体蛋白分子间的相互作用， 因此其结合特性 均具有特异性、饱和性、可逆性和竞争性结合等特点，并具有手性识别能力。CMC法与RBA和功能受体动力学的相关研究证明，三种方法测得的7种配体 及其异构体对M、a、B受体亲和力参数顺序一致，并具有明显的相关性。CMC技术已经成功用于钙阻滞药的受体-配体结合反应研究和立体异构体的 识别。2）细胞膜固定相具有细胞膜活性筛选和色谱分离的双重功效CMC技术可对药物-受体亲和力进行定性和定量分析，同时对结合状态的 化合物进行色谱分离。这种双重功效为药物筛选和分离提供了非常有效的实验 平台。特别是在中药研究中，可有效地分

7、离出中药有效成分，并进行其受体亲 和力（匕）测定。CMC技术已成功应用于中药有效成分的筛选和色谱分离 1923。4）具有稳定、简捷、高效特点CMC法与放射配体结合法比较，细胞膜受体不是处于溶液中,而是固定于 硅胶载体表面上，因而方法更简便；由于色谱柱可重复使用和膜蛋白消耗量少， 筛选效率高，稳定性高，变异性很小；由于不需要特殊的放射性配体，没有放 射性污染；如果用激光诱导荧光检测手段，CMC法的灵敏度可超过 RBS。与功能受体动力学方法相比，CMC法具有更高的灵敏度和精确度。与人工膜亲和 色谱法相比，CMC法保持了硅胶载体表面蛋白的生物活性， 因此必须在膜受体 活性期内，在37c条件下进行实验

8、。CMC法具有简便、准确、可靠、具有生 物活性、色谱柱可重复使用等优点，如果实现自动化测定，可发展为药物高通 量筛选的新方法。CMC模型的适用范围由于CMC法用的是自然生物膜，膜受体的密度较小，对亲和力低的药物 精确度较低，对于许多紫外光谱范围外或边缘的化学物质（如多数M受体配体） 的检测灵敏度还不够满意7,此时应该代之以荧光检测。CMC不能判断化合物 在靶体-配体结合后的内在活性和效应特征， CMC法必须配合功能靶体动力学 筛选等方法，才能确定某些有效化合物，从而确定目标化合物。对于弥散分布 或重量太小组织（某些神经核团，内分泌组织）尚无法进行常规CMC研究，此时常需要进行细胞原代培养或细胞

9、株的传代培养，获得足量的细胞后才能进 行CMC研究。二、细胞膜色谱法的基本研究方法1.前沿色谱分析24-26CMC法实质上是一种新的具有生物活性的仿生色谱系统，药物分子与细胞111=十 M LappKaM lD Ml膜及膜受体（配体-靶体）间的动态相互作用特性，仍然可以用前沿色谱的3方法分析，通过制作药物分子的突破曲线，并由以下关系计算出配体的Kd值。前沿色谱分析结果可用Scatchard-Plot或其他方法分析，上式中MLapp为达 到平均突破点的药物摩尔数，D为流动相中的药物浓度，Ka为药物分子与膜 受体作用的平衡常数，Ml是柱中受体蛋白结合位点数。如果考虑非特异结合， 上式变为：_21_

10、 1 DKa（1 DKa）1Vmax -V - VminPKaXVmJPKaX 而式中，V是药物的洗脱体积，P是柱中受体结合位点浓度，Vmin是特异结合 被抑制后，药物的洗脱体积。Vmin可通过下式得到，公式中，X是与D作用与同 一位点的添加物浓度，Vmax是D足够小时的洗月体积（当D1/K a时，V=Vmax）, V|是存在竞争时的D的洗脱体积。下式回归可求出 Vmin （当凶趋11=D V -Vmin Vmin P Ka VminP进于无穷大时，V|=Vmin）。.常规色谱分析将已知浓度的待测物加于流动相中，持续作用于膜色谱固定相，药物与受 体蛋白逐渐结合并达饱和，此时从柱上洗脱下来的溶质

11、量迅速增加，形成具有 特征的曲线裂断。曲线上的平均裂断位点只和溶质浓度、柱中受体数目、溶质 配体平衡解离常数有关。在 CMC系统中，药物分子与细胞膜及膜受体（配体 - 靶体）间的作用，可以直接用反映其保留特性的容量因子（kO来表示，k，越 大，则药物分子与细胞膜及膜受体的作用强度越大；反之，则药物分子与细胞 膜及膜受体的作用强度越小。k可由下式获得：k，= （t r- t o） / t 0其中t R是药物分子在色谱系统中的保留时间，t 0是死时间。三、细胞膜色谱法在中药研究中的应用中药和西药的本质都是物质的，但其化学组成正好构成了两个极端体系， 中药是复杂体系，西药是简单体系。而不同细胞膜色谱

12、色谱模型可成为中药与4药用植物中药效物质筛选的技术平台。目前，我们已对123种中药和60多种药用植物进行了快速筛选，确定了其中的活性部位和活性成分，再经“组织、 整体”水平的药理实验验证，部分有效部位和有效成分可作为“候选药物”进 入新药开发程序。“四物汤”物质基础研究复方是中药的精髓和奥妙所在，应用多种不同 CMC模型可对中药复方进 行“多靶点、多途径”的研究。并以中药药效物质为基础借鉴中医理论的宏观 指导思想，利用西医理论的对证指导原则，研究开发“成分明确、机理清楚、 量效相关、质量可控、疗效确切”的以部位或成分为单位的现代复方制剂。（1）动物“心、脑、血管细胞膜色谱筛选模型”建立传统上，

13、一般用整体动物模型筛选研究中药方剂， 只解决了中药方剂的有效 性问题，而无法证明其有效性的物质基础， 以及在分子、细胞和组织水平上的作 用机制。本项目利用细胞膜色谱方法，首次建立了适应于研究“四物汤”体系的 动物“心、脑、血管细胞膜色谱筛选模型”，实现了对“四物汤”体系中药效物 质的体外仿生学快速筛选，再结合离体和整体药效实验，构成了一个以“细胞膜 色谱筛选模型”为特点的有效筛选体系，并成功地用于“四物汤”经典方剂的研 究。研究结果表明：建立在“分子、细胞、组织、整体”水平上的有效筛选体系， 在发现中药方剂药效物质和作用靶位的同时， 将有助于在一定程度上阐明中药复 杂体系“多途径、多靶点、综合

14、性”特点，进而为中医药现代化提供可应用的新 的研究模式和研究方法。（2）四物汤中作用于“心、脑、血管靶细胞”的主要物质基础1）有效部位筛选 应用动物“心、脑、血管细胞膜色谱筛选模型”对四物 汤中熟地黄、当归、白芍、川茸进行体外快速筛选，结果：当归、川茸挥发油 等极性较小的脂溶性部位在“心、脑、血管模型”上显示出较强的类似于阳性药 （维拉帕米、尼莫地平）的保留特性，是作用于心脑血管靶细胞的有效部位； 白芍醋酸乙酯部位在“脑、血管模型”上显示出一定的保留特性，是作用于脑和 血管靶细胞的有效部位；熟地黄水溶性部位对离体胸主动脉血管收缩和蛙心收 缩均有抑制作用，是作用于血管和心肌靶细胞的有效部位。2）

15、有效成分分离 用液相色谱/质谱（HPLC/MS）、气相色谱/质谱（GC/MS）、 红外光谱（IR）、紫外光谱（UV）和元素分析等现代分离分析技术，结合“心、 脑、血管细胞膜色谱筛选模型”，对各有效部位进行了系统分离、跟踪筛选和结 构分析。结果：当归和川茸有效部位中的藁本内酯为作用于心和血管靶细胞的5主要有效成分；当归和川茸有效部位中的丁烯映内酯为作用于心和脑靶细胞的 主要有效成分；熟地黄和白芍有效部位中作用于心、脑和血管靶细胞的有效成 分含量甚少，所以分别将熟地黄水溶性有效部位中的梓醇和白芍醋酸乙酯有效部 位中的芍药音作为指标成分，以控制其质量。（3）四物汤的有效部位方剂对“心脑血管系统”有较

16、强的综合药效作用在对四物汤进行筛选、分离和分析研究基础上，组成四物汤的传统方剂（水 提物方剂和醇提物方剂）、有效部位方剂和有效成分方剂，并进行相关的离体和 整体药效学验证。1）四种不同方剂对去甲肾上腺素（NE,图1）、氯化钾（KCl,图2）和氯化钙 （CaCl2,图3）所致的胸主动脉血管收缩均有抑制作用，且有效部位方剂明显强于 传统方剂，也较强于有效成分方剂；四物汤中有效成分有类似于钙拮抗剂的作用 特性，并呈非竞争性拮抗作用。87654NE(-log mol/L)100 _80 _) -%60(率，缩 40-收，200-8765NE(-log mol/L)图1曲线（n=6）四物汤有效部位方剂与

17、维拉帕米对NE所致兔主动脉条收缩反应量效对照0.005 mmol/L0.01 mmol/L0.05 mmol/L120 -10080,100 _80 _-202.52.01.51.00.50.0KCl(-log mol/L)-201111112.52.01.51.00.50.0KCl(-log mol/L)对照 0.1g/mL0 0.2g/mL0 0.4g/mL图2四物汤有效部位方剂与维拉帕米对KCl所致兔主动脉条收缩反应量效曲线（n=6）图3四物汤有效部位方剂与维拉帕米对 CaCl2所致兔主动脉条收缩反应量 效曲线（n=6）2）四种不同方剂对异内肾上腺素所致的离体蛙心收缩和心率增加均有抑制

18、作用（表1）,且有效部位方剂明显强于传统方剂和成分方剂。表1四物汤方剂对离体蛙心心肌收缩力和心率影响（n = 8）样品浓度/ %/ %空白对照组任氏液1.00:0.0101.01O010维拉帕米4 一c -10.2 mg?mL0.540.08460.600.184010.1 g?mL10.740.11260.910.079水提物方剂10.3 g?mL10.650.11350.790.132110.9g?mL10.470.12530.470.2353-10.1 g?mL0.780.11220.920.068醇提物方剂10.3 g?mL10.700.11300.820.1518-10.9 g?mL

19、0.630.12270.700.243010.1 g?mL10.690.04310.880.0812有效部位方剂10.3g?mL10.580.06420.710.222910.9 g?mL10.470.09530.440.185610.1 g?mL10.880.06120.900.1010有效成分方剂-10.3g?mL0.760.08240.840.111610.9 g?mL10.62*380.730.16273）用氟化钾、亚硝酸钠和常压生石灰法制备小鼠脑缺氧模型，分别观察“四物汤”传统方剂（水提物方剂、醇提物方剂）、有效部位方剂、有效成分方剂对 小鼠脑缺氧的保护作用。实验结果表明，四物汤传统

20、方剂、有效部位方剂和有效 成分方剂对小鼠脑缺氧均具有保护作用，且有效部位方剂明显强于传统方剂和成 分方剂。表2四物汤方剂抗氟化钾中毒致小鼠缺氧实验结果（）(min)tp空白对照组123.6比2尼莫地平125.5222.6870.05醇提物方剂124.3061.8300.05有效部位方剂125.7比73.4610.01有效成分方剂125.4比63.2050.01注：空白对照组灌胃相同体积的生理盐水，尼莫地平浓度为40mg/kg,四种方剂以生药量计浓度为10g/kg。表3四物次万剂抗常年下小白鼠缺氧实验结果组别动物数（只）存活时间min)t检验P值空白对照组1214.4力.0尼莫地平1216.8力

21、.44.8090.01水提物方剂1215.6力.62.1960.05醇提物方剂1215.7力.82.2110.05有效部位方剂1216.5力.93.4390.01有效成分方剂1215.7力.62.4200.05注：空白对照组灌胃相同体积的生理盐水，尼莫地平浓度为40mg/kg,四种方剂以生药量计浓度为10g/kg。表4四物汤方剂抗常压下致小白鼠缺氧实验结果()()t检验P空白对照组1215.7 20一一尼莫地平1222 73.0760.01水提物方剂1219 52.2040.05醇提物方剂1219坨2.140.05有效部位方剂1220 52.7110.05有效成分方剂1219 42.3120.

22、05注：空白对照组灌胃相同体积的生理盐水，尼莫地平浓度为40mg/kg,四种方剂以生药量计浓度为10g/kg。都梁方剂物质基础研究利用“溶剂萃取、快速自动色谱和多通道制备 HPLC”的高通量分离技术, 完成“从植物到样品”的快速分离制备建立起起了白芷和川茸的不同层次样品 库。用细胞膜高表达受体色谱模型，分别对白芷和川茸样品库和化合物库中样 品进行系统筛选，分别发现了具有心脑血管活性的白芷有效成分欧前胡素和异欧前胡素以及川茸的有效成分藁本内酯和丁烯味内酯离体药理实验表明白纸有效部位及有效成分、川茸有效部位均能显著对抗 去甲肾上腺素诱发的兔离体胸主动脉条收缩，量效关系明显。通过筛选分别组 成都梁方

23、剂的不同活性部位和活性成分方，整体药理实验表明对原发性高血压 有缓解作用并随即量增加而增强，在急性降压实验中，对肾性高血压大鼠有明 显降压作用。对心率影响无统计学意义。其他中药物质基础研究太白花物质基础研究太白花为石蕊科植物雀儿石蕊的枝状体。为秦巴山区特有药用植物。利用细胞膜色谱法，分别以健康犬的血管、心肌细胞膜建 立细胞膜色谱筛选模型，首先对太白花的各提取部位进行系统筛选。结果发现太白花乙醴提取部位对血管有作用。 在此基础上对该部位进行柱色谱分离， 并 利用血管细胞膜色谱跟踪筛选，分离出活性成分TBHG8 o并具有较强的量效关系。采用离体蛙心实验对TBHG8进行药理学实验，结果发现对离体蛙心

24、心肌 收缩力具有较强的抑制作用。结果与细胞膜色谱法筛选结果具有显著的相关 性。红毛七物质基础研究红毛七为小集科植物类叶牡丹的根茎及根。实验中选用犬血管细胞膜制备血管细胞膜色谱模型，对红毛七的各药用部位结果表 明红毛七对血管有作用的活性部位为甲醇提取物。利用薄层色谱、柱色谱分离，并经血管细胞膜色谱筛选，分离出活性成分 HMQ-54和HMQ-52。采用兔离体主动脉条实验，考察了 HMQ-54和HMQ-52对去甲肾上腺素 所致动脉条收缩的拮抗作用，结果表明HMQ-54对去甲肾上腺素引起的兔主动 脉条收缩呈现剂量依赖性的竞争性拮抗作用，而 HMQ-52作用较弱。四、细胞膜色谱法生物学研究进展高表达细胞

25、原代培养的CMC研究我们成功进行了心肌细胞、内皮细 胞、血管平滑肌细胞、肝脏细胞的原代培养，并制备了这些细胞的色谱柱。9细胞株的传代培养的CMC研究 利用课题所需要的细胞株（内皮细胞、 月中瘤细胞等），我们制备了色谱柱，并成功进行了细胞株的CMC研究。02和a i肾上腺素受体亚型细胞系和转基因动物的制备成功 27,28为CMC的生物 学研究开辟了新的研究方向，促进了 CMC的研究进展。我们成功制备了高 表达的a id受体亚型色谱柱，进行了 9种a肾上腺受体配体对a id受体的亲 和色谱（k）排序，与RBA的受体亲和力（Kd）的顺序一致，并具有高度正 相关性。a ia受体和a ib受体亚型的细胞

26、膜色谱柱已制备成功，并与相应的 配体药物进行了 CMC的受体亲和力研究29。在CMC的生物学研究中，通常我们拟采用的研究路线是：受体质粒 （cDNA）的获得与扩增 -质粒转染-受体或受体亚型高表达细胞株建立 -细胞膜色谱柱制备 -特异性配体的CMC结合实验-药物功能分析。CMC技术在6项国家自然科学基金和多项其他基金的重点支持下，经过我们课题组的多年的努力，使得 CMC方法在基础理论、基本技术、应用基础和 开发研究等方面取得了一些进展， 并通过多方面的实践积累了一定的经验， 初 步形成了较为完整的理论、技术与应用体系。尤其是作为研究靶体-配体相互作用的新方法，希望在药理学研究领域得到更为广泛地

27、应用，并在实践中不断地改进、完善和发展。部分硕士研究生毕业论文.杨广德用细胞膜色谱法研究阿托品类药物与M-受体的相互作用1998.赵惠茹 当归有效部位的细胞膜色谱法筛选和体内过程研究，2000.牛晓峰陕西叶下珠药用研究，2000.张汉利 太白花活性成分的CMC法筛选和兔体内过程研究，2001.邓喜玲丹参素及其衍生物的合成与结构分析，2001.高琨用细胞膜色谱法分析研究红毛七中的有效成分，2001.李洪玲 心康平原料药质量标准和体内过程研究，2001.梁明金 现代中药BC-11质量标准及兔体内代谢研究，200110.赵晓娟 用细胞膜色谱法筛选淫羊霍根的有效成分,2001.刘 飞 用细胞膜色谱法分

28、析人参中的有效成分,200211岳瑞天花粉降糖活性部位的CMC法筛选及其药效学研究,2002.王树春天冬与四物汤方剂质量分析及其中药材X射线衍射Fourier指纹图谱鉴定研究，2002.王茂义降糖灵质量标准和体内过程研究，2002.马 瑛 BC-11降压中药CMC筛选及作用机理研究，2002.闫豫君 细胞膜色谱法筛选丹参中的有效及药理作用研究，20021贺浪冲，耿信笃.细胞膜受体色谱法 一研究药物与受体作用的新方法.生 物医药色谱新进展，1996; 3:8Langchong He ,Sicen Wang and Geng Xindu. Coating and fusing cell membr

29、ane onto a silica surface and their chromatographic characteristics， Chromatographia, 2001,54:77He Langchong， Yang Guangde and Geng Xindu. Enzymatic activity and chromatographic characteristics of the cell membrane immobilized on silica surface, Chinese Science Bulletin, 1999,44(9):8264贺浪冲，杨广德，耿信笃.固

30、定在硅胶表面细胞膜的酶活性及其色谱特性.科学通报，1999,44(6):6325贺浪冲，耿信笃.一些酸性药物在正相硅胶/反相洗脱色谱中保留机理研究.药学学报，1998,33(1):426贺浪冲，杨广德，王嗣岑.用细胞膜色谱法研究钙拮抗剂与钙通道受体相互作用.中国病理生理杂志,1998, 147(7):9597王树春，贺浪冲.中药材川考的射线衍射Fourier谱分析.中药材，2002,25(6):3999赵惠茹，杨广德，贺浪冲.用细胞膜色谱法筛选当归中有效成分.中国药学 杂志，2000,35(1):1310梁明金，杨广德，贺浪冲.白芷中欧前胡素提取方法研究.中成药， 2000,22(12):82

31、911李洪玲，杨广德,贺浪冲.心康平原料药鉴别和含量测定.药物分析杂志， 2001,21(5):34812赵晓娟，贺浪冲.用细胞膜色谱法筛选研究淫羊霍地下部分有效成分.分析化学，2002,30(2):19513高琨,贺浪冲，杨广德.用细胞膜色谱法分析研究红毛七中的有效成分.中国药学杂志，2003,38(1):1414张汉利，杨广德,贺浪冲，等.太白花活性成分的筛选与药理作用相关性研11究.中国药学杂志,2003,38(2):9215闫豫君，杨广德，贺浪冲.RP-HPLC法同时测定丹参中丹参酮IIa和隐丹参酮的含量.中草药,2002,33(4):36316刘 飞，贺浪冲.人参质量控制的定性与定量

32、方法研究.药物分析杂志，2002,22(3):160参考文献贺浪冲，耿信笃.细胞膜受体色谱法一研究药物与受体作用的新方法，生物医药色谱新进展，1996; 3: 8-9博士论文He LC, Yang GD, Geng XD. Enzymatic activity and chromatographic characteristics of the cell membrane immobilized on silica, Chin Sci Bull 1999; 44(9): 826-31He LC, Wang SC, Geng XD. Coating and fusing cell membran

33、e onto a silica surface and their chromatographic characteristicsC. hromatographia 2001; 54(1/2): 71-6He LC, Yang GD, Wang SC, et al. Enantionseparation of dihydropridine calcium antagonists on the cell membrane immunoadsorbent in high performance liquid chromatography. The third international sympo

34、sium of worldwide Chinese scholars on analytical chemistry 1998(ISWCSAC 98 Hong Kong); 346-7Hou J, Yuan BX, He LC, et al. Evaluation of drug-muscarinic receptor affinities by using cell membrane chromatography. Chin J Pharmacol & Toxicol 2003; 17(1): 70-3.贺浪冲，杨广德，王嗣岑等.用细胞膜色谱法研究钙通道受体的相互作用.中 国病理生理学杂志

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36、H11110A to functionally discriminate between a1-adrenoceptor subtypes A, B and D or between a1-and a2-adrenoceptorsEur. J Pharmacol2001; 415(2): 265 6.Tasta R,Destefani C,Guarneri L, et.al. The a1d-adrenoceptor subtype is involved in the noradrenaline-induced contractions of rat aorta. Life Sci 1995

37、; 57(13): 159-63Buckner SA, Oheim KW, Morse PA, et al. a-adrenoceptor-induced contractility in rat aorta is mediated by the 印 subtype. Eur J Pharmacol 1996; 297: 241 -8Kasai KI , Ishii SI. Quantitative analysis of affinity chromatography of trypsin. A new technique for investigation of protein-ligan

38、d interaction. J Biochem1975; 77(1): 261-4Brekkan E, Lundqvist A , Lunaahl P. Immobilized membrane vesicles or proteoliposome affinity chromatography Frontal analysis of interactions of cytochalasin B and D-glucose with the human red cell glucose transporter.12Biochemistry 1996; 35(4): 12141-5Karlss

39、on R, Stahlberg R. Surface plasmon resonance detection and multispot sensing for direct monitoring of interactions involving low-molecular-weight analytes and for determination of low affinities. Anal Biochem 1995; 228(2): 274-80Mackenzie CR, Hirama T, Lee KK. Quantitative analysis of bacterial toxin affinity and specificity for glycolipid receptors by surface plasmon resonance.J Biol Chem1997; 272: 5533-8Berry JA, Burgess AJ, Towers P. Scintillation proximity assay: compe