高级生理学实验方法课件

1、神经系统电生理学实验方法陈 蕾 南京医科大学 生理学系 主要内容神经系统电生理学实验记录的基础常用神经电生理学实验记录的方法与疼痛有关的神经系统电生理记录方法与学习记忆有关的神经系统电生理记录方法一、神经系统电生理学实验记录的基础1.神经细胞是可兴奋性细胞。兴奋：细胞、组织或者机体由静止转为活动或者活动由弱变强。可兴奋细胞：凡在受刺激后能产生动作电位的细胞。兴奋性：可兴奋细胞受到刺激后产生动作电位的能力。刺激：细胞所处环境因素的变化（物理、化学等）。一、神经系统电生理学实验记录的基础2.神经细胞的生物电现象 单个神经元：静息膜电位（安静） 动作电位（受到刺激） 神经元之间的信息联系：突触（电-

2、化学-电）静息电位(resting potential，RP)：指细胞在未受刺激时存在于细胞膜内外两侧的电位差。 特点：负电位-10-100mV静息状态下细胞膜内、外离子分布不匀 膜内：膜外：主要离子分布：静息状态下细胞膜对离子的通透性具有选择性 RP产生机制 Ki顺浓度差向膜外扩散A-i不能向膜外扩散K+i膜内电位(负电场)K+o膜内电位(正电场)膜外为正、膜内为负的极化状态当扩散动力与阻力达到动态平衡时=RP结论: 静息电位主要是由K+外流形成的；接近于 K+外流的平衡电位。动作电位动作电位（action potential，AP）：可兴奋细胞受到适当刺激，受刺激处的细胞膜两侧出现一次快速

3、而可逆的电位变化，称为AP上升支AP下降支神经元之间的信息传递经典的化学突触（主要）突触小体轴浆内有较多线粒体和大量含有各种递质的囊泡（突触小泡）。突触后膜上存在相应的特异性受体或化学门控性通道。突触兴奋的传递过程兴奋传至神经末梢 突触前膜去极化 前膜电压门控式Ca2通道开放 Ca2进入突触前膜 神经递质通过出胞作用释放到突触间隙递质作用于突触后膜的特异性受体或化学门控式通道突触后膜上某些离子通道通透性改变某些离子进入突触后膜 后膜去极化或超极化 （突触后电位）电-化学-电的传递过程 长时程 (long-term) 突触可塑性长时程增强（long-term potentiation，LTP )

4、突触前神经元在受到短时间内快速重复性刺激后，突触后神经元所产生的一种快速形成的和持续性的突触后电位增强。 长时程抑制(long-term depression，LTD) 突触前神经元在受到短时间内快速重复性刺激后，突触的传递效率长时程降低。 LTP与LTD产生机制相似，都是Ca2进入突触后神经元引起，但有所不同： LTD：少量Ca2内流，轻度去极化(20 mV) LTP： 大量Ca2内流，轻度去极化大的多。海马的突触可塑性突触后膜的电位改变取决于同时产生的EPSP和IPSP的代数和。轴突始段是首先爆发动作电位的部位。始段爆发的动作电位向两个方向扩布，逆向扩布的动作电位将刷新神经元胞体的状态。动

5、作电位在突触后神经元的产生 二、常用神经电生理学实验记录的方法（一）在体记录：脑立体定位技术 脑立体定位术已成为研究现代神经解剖学、神经生理学、神经药理学、实验神经科学及实验神经病学所广泛采用的手段之一。应用脑立体定位术可将微细的电极、导管插入脑的深部结构，配合使用相应的仪器可对其进行刺激、毁损、微量注射药物以及引导出脑的局部结构或单个细胞的电活动，以研究脑的结构和功能。 脑立体定位仪的发展史20世纪初，第一台脑立体定位仪是由英国学者Clake设计制造。另一学者Horsely利用立体定位仪进行了研究工作，并将其结构与使用方法发表。因此，又称为“Horsely-Clake立体定位仪”。至20世纪

6、30年代后，立体定位仪被重视并应用于科研中。如瑞士生理学家Hess（1932）利用它刺激下丘脑并创造了埋植电极的慢性动物实验方法；脑干网状结构生理学著名研究专家Magoun也曾利用定向器做出了卓越的贡献。立体定向器的种类 根据其结构原理，当今使用的立体定向器可分为两类：直线式或三平面式，它以三个假想的互相垂直的平面作为一组立体坐标，电极可按这三个平面的方向移动。通过立体坐标的读数平确定脑的深部某一结构的空间位置。动物实验多用此类。另一类是赤道式，它由两个互为直角的半圆弧梁构成，电极可沿两弧的方向移动，通过坐标来确定脑某一深部结构的位置。赤道式多用于人脑定向器，使用于神经外科手术。直线式脑立体定

7、位仪的使用原理 利用动物颅骨表面的某些解剖标志，如矢状缝、前囱中心、人字缝以及外耳道的中心轴、上门齿根部、眶下缘中央部等部位，同脑表面及深部某一结构的相对恒定关系，借以从外部确定脑深部各结构的位置；利用立体三角的立体坐标原理，以毫米为单位来规定动物脑内某一结构的位置。 直线式脑立体定位仪的使用方法用一坚固、准确而两端对称的头夹，将动物的头非常牢固地固定起来（不允许有1/5mm的移动）。另用一组三个互成直角的滑动尺构成电极移动架。滑尺的刻度要求能读出1/10mm。电极移动架上装有电极夹，电极装上后可以沿三个平面作前后、左右、上下移动，并可以按一定的平面转成一定的角度，使电极准确地插入脑内某一结构

8、。例如，小鼠侧脑室的定位：(前囟后0.3 mm ，旁开 1.0 mm，深度 2.5 mm)。具体应用海马回路实验结果（二）离体记录：脑片场电位记录在脑片上，神经组织的三维结构相对完整，含有一些特殊的突触联系，易于作通路刺激。刺激某些突触联系的突触前纤维，在突触后神经元上可以记录到相应的膜电位改变。记录电极所记录到的是在其附近一群细胞的膜电位改变的总和。例如，制备海马脑片，刺激Schaffer侧枝，在海马的CA1区锥体细胞层可以记录到场电位，在辐射层可以记录到兴奋性突触后电位。基本步骤：制备海马脑片：成年大/小鼠经乙醚麻醉后快速断头取脑，置于0-4 冰冻人工脑脊液中1 min备用。鼠脑稍加修饰后

9、移至振动切片机浴槽内，在0-4 人工脑脊液中切取包含海马的冠状脑片3-6片（厚度350 m）。 将切好的脑片迅速转移至持续通混合气的氧饱和人工脑脊液中，在28 左右孵育至少60 min后移至记录浴槽。ABCA:海马立体结构图B:尼氏染色后的海马冠状切片C:海马脑片刺激、记录电极放置模式图（二）离体记录：细胞膜片钳记录1976年由德国马普生物物理化学研究所的Neher和Sakama首次报道了应用膜片钳技术在蛙胸皮肌细胞膜上记录到单通道电流。膜片钳技术是研究离子通道的“金标准”，应用该技术可以证实细胞膜上离子通道的存在，并能对其电生理特性、分子结构、药物作用机制等进行深入的研究。 膜片钳技术简介1

10、950s: Hodgkin和Huxley建立了细胞内微电极电压钳技术，并在神经轴突上测到离子通道电流，提出了离子通道的概念，阐明了动作电位的离子基础。1963: Hodgkin 和Huxley由于在电生理和电压钳技术的贡献被授予Nobel生理和医学奖 。1976: Neher 和 Sakman在单个蛙骨骼肌纤维上首次用膜片钳技术记录到单通道离子通道电流，1981年对该技术进行了改进，用负压建立G封接。1991: Neher和Sakmann因为该技术获得Nobel生理和医学奖。膜片钳术的基本原理膜片钳技术是用微玻管电极（尖端直径约15 m）接触细胞膜而不刺入，然后在微电极另一端开口施加适当的负压

11、，将与电极尖端接触的那一小片膜轻度吸人电极尖端的纤细开口，这样在这小片膜周边与微电极开口处的玻璃边沿之间，会形成紧密的封接，在理想的情况下其电阻可达数个或数十个千兆欧姆以上的高阻抗封接，使与电极尖开口处相连的细胞膜的小区域（膜片）与其周围的细胞膜在电学上完全分隔，如果在这一小片膜中只包含了一个或少数几个通道蛋白质分子，那么通过此微电极就可测出单一通道开放时的离子电流和电导，并能对单通道的其他功能特性进行分析。几种膜片钳记录模式膜片钳记录中细胞的来源：急性分离细胞培养脑片急性分离的海马神经元培养的三叉神经节神经元海马脑片的锥体神经元膜片钳可以记录1.离子通道（细胞）2.突触传递（脑片）3.动作电

12、位疼痛产生的一般过程伤害性刺激作用于外周感受器(伤害性感受器)换能后转变成神经冲动(伤害性信息)，循相应的感觉传人通路(伤害性传人通路)进人中枢神经系统，经脊髓、脑干、间脑中继后直到大脑边缘系统和大脑皮质，通过各级中枢整合后产生疼痛感觉和疼痛反应。三、与疼痛有关的电生理实验方法痛觉调制的机制外周机制中枢机制伤害感受器 离子通道功能状态、数目 炎性介质可塑性改变兴奋性突触传递增强抑制型突触传递减弱与痛觉有关神经递质的调控高位中枢的调控痛觉研究中常用的细胞：背根神经节神经元、三叉神经节神经元应用膜片钳技术可以研究伤害感受器（背根神经节神经元、三叉神经节神经元）的兴奋性三叉神经节神经元上记录到的四种

13、动作电位分析动作电位的形态研究动作电位的数目应用膜片钳技术可以研究伤害感受器离子通道的功能状态电压门控性离子通道配体门控性离子通道: TRPV1, ATPNa: TTX-S (Nav1.1, 1.2, 1.3, 1.6, 1.7), TTX-R (Nav1.5, 1.8, 1.9)K: IK (Kv1.2) IA (Kv1.4)Ca: HVA (L- Cav1.3, N-Cav2.2, R-Cav2.3) LVA (T-, Cav3.1)全细胞膜片钳记录到的电压门控性离子通道的电流图形电压依赖性钠通道总钠电流TTX-非敏感性钠通道TTX-敏感性钠通道电流幅度电流电压关系曲线激活曲线失活曲线TR

14、PV1受体介导的电流全细胞膜片钳记录到的配体门控性离子通道的电流图形量效曲线受体的失敏现象电流电压关系曲线单通道电流图形通道开放的机率通道开放的幅度脊髓脑片的突触传递功能的研究伤害感受器是痛觉由外周向中枢传导的第一站，初级感觉神经纤维与次级感觉神经元在脊髓后角形成第一个中枢性突触，因此脊髓是疼痛信息综合处理的一个主要部位。脊髓后角(在脑干与它相当的是三叉神经脊束核尾侧亚核)浅层,尤其是II层(胶状质,Substantiagelatinosa,SG)是外周躯体性伤害性信息的主要投射部位，也是脑内下行抑制系统的投射部位，因此该部位是阐明伤害性信息在中枢内传递和调控机制的关键。脊髓脑片的制备动物麻醉

15、后沿背正中线由骶髓水平向上到胸髓水平剪开背部皮肤,用小组织剪沿椎骨棘突两侧剪开肌肉,暴露横突,切除椎板,暴露脊髓,避免损伤脊髓表面的血管，1min内快速取出脊髓。从下端腰骶段向上至胸髓水平,横断脊髓,连同蛛网膜和软膜一并取出,在高倍显微镜下除去蛛网膜和软膜,避免损伤脊髓背角组织。用速粘胶将约1cm长的脊髓粘立于振动切片机载物台上,用振动切片机切片,片厚为400m。将脊髓薄片标本在含95%O2和5%CO2的人工脑脊液中孵育至少1h。脊髓背角LTP的在体记录C类纤维是重要的痛觉传入纤维，因此脊髓背角C纤维诱发电位LTP是痛觉调制的重要中枢机制。方法：SD雄性大鼠乌拉坦麻醉气管插管和颈外静脉插管在胸13-腰1 (T13-L1)行椎板切除术，暴露脊髓腰膨大游离左侧坐骨神经双极氯化银电极刺激坐骨神经用钨丝微电极在脊髓腰膨大背角浅层记录C纤维的诱发场电位四、与学习记忆有关的电生理实验方法学习记忆的电生理基础海马是脑内与学习记忆关系最密切的一个脑区。海马内存在三突触回路联系。海马脑区的L