质粒DNA的提取及检测实验二课件

1、实验二 质粒DNA的提取及检测实验目的1 学习碱裂解法提取质粒的原理和方法。2 学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。菌种接种根据所选择的荧光蛋白基因的菌种进行接种：DH5-pEGFP-N3（绿色）卡那霉素抗性DH5-pDsRed1-N1 （红色）卡那霉素抗性DH5-pET- 28a （表达载体）卡那霉素抗性接入LB液体培养基6ml+12l (20mg/ml)kana 另每组配制200mlLB (Kana) 固体培养基 ， 倒10个平板。一、实验原理分离质粒DNA的方法一般包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增 收集和裂解细菌 分离和纯化质粒DNA一、 实验原理（碱裂解法）溶液 ：50mmol/

2、L 葡萄糖， 10mmol/ EDTA-Na， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 溶液 ：0.4mol/L NaOH ， 2% SDS 临用前1：1配制。溶液 ：5mol/L 醋酸钾 60ml 冰醋酸 11.5ml 双蒸水 28.5ml作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀二、实验用品1、仪器 恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台， 10、100、1000L微量移液器各一支， 台式高速离心机，制冰机，混合漩

3、涡器。台式高速离心机制冰机微量移液器漩涡混合器二、实验用品2、材料：事先培养好的含三种质粒菌液1.5ml塑料离心管EP管架微量取液器和取液器吸头常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、试剂瓶等） 二、实验用品3、试剂LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g，琼脂（固体培养基）15g，用 1N NaOH调pH 7.5。溶液 ，溶液 ，溶液 卡那霉素(20mg/mL)，工作浓度40g/ml抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ） 作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离。平衡酚密度大，可是DNA在上清中。异戊醇防止抽提液

4、起泡。无水乙醇 作用：除去DNA水化层，使DNA沉淀。70%乙醇 作用：纯化质粒DNA。含RNA酶的ddH2O 作用：溶解DNA三、实验步骤（1）将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌接种在液体培养基中（加卡那霉素40g/mL），370C培养过夜。取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm2min，弃上清液。加入100L溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min。 加入200L新配制的溶液，轻轻翻转23次，使之混匀，冰上放置5 min。 三、实验步骤（2）加入150L冰冷的溶液，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min。 100

5、00rpm 5 min，取上清液于另一干净的离心管中。向上清液中加入等体积（约400L）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm 10 min，将上清液转移至新的离心管中。 加入等体积（约370L）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min ,取上清液于新离心管中 三、实验步骤（3）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀， -200C放置30min。12000rpm 5 min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 加0.8mL70%乙醇，离心1 min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min。 加30L ddH2O ，-200C保存备用。四、 注意

6、事项 1）饱和酚（取下层）单独吸，氯仿：异戊醇（24：1）吸。 2）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II 和III ），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用。 3）在取各种试剂的过程中，一定注意移液器吸头的更换，避免污染。1.2 DNA琼脂糖凝胶电泳检测 电泳：带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。 DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。 DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。一 实验原理一 实验原理 在质粒提取的过程中，由

7、于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。 当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒 DNA泳动速度：闭环超螺旋线状开环。 但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料含量有关。 1、仪器 电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，水平仪，取液器，微波炉，凝胶成像系统。 二、实验用品凝胶电泳系统凝胶成像系统二、实验用品2、材料： 提取的质粒溶液 ，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，剪刀，取液器吸头。3、试剂： Gold view（DNA染料） 0.5TAE缓冲液 上样缓冲液（6） 三、实验步骤1、琼脂糖凝胶板的制备 称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mL1TAE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解。 待胶液冷却到650C（不烫手为宜），加入1L Gold view混匀，搅拌器上搅拌排除气泡，（如右图）缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子 ）内 。静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子。三、实验步骤2、加样 胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入1TAE缓冲液淹没过胶板1mm，用取液器将提取的质粒DNA5L与1L Loading Buffer（ 6 ）混匀，加入胶板的样品小槽内。3、电泳