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文档简介

1、第六节 核酸的分离与鉴定一、核酸的分离（一）DNA的分离提取DNA最基本的原则是保持DNA的完整性。影响完整性的因素： 机械损伤； 细胞内源DNAase(cofactor: Ca2+,Mg2+)的作用； 化学因素DNA核蛋白溶解特点： 溶于水和浓盐溶液（1 mol/L NaCl） 不溶于生理盐溶液（0.14 mol/L NaCl）DNA分离技术要点：DNA提取（浓盐溶液、 EDTA、SDS、蛋白质酶K）DNA沉淀（水稀释或异丙醇）苯酚(水饱和)抽提除去蛋白乙醇沉淀DNA氯化铯密度梯度离心进一步纯化（二）RNA分离RNA不稳定！RNA酶非常稳定！提取RNA的关键在于尽可能完全抑制RNA酶的活性。

2、抑制RNase的措施：器皿特殊处理使用蛋白质强变性剂使用RNAase 抑制剂RNA制备: 酸性胍盐/苯酚/氯仿 抽提 氯化铯 密度梯度离心二、核酸的超速离心氯化铯(8.0 mol/L)密度梯度1.80 g/cm3 1.55g /cm3密度: RNADNA蛋白质核酸超速离心的用途: 1. 分离核酸(含荧光染料溴化乙锭, EB) 2. 核酸构象研究 超螺旋DNA环状DNA线型DNA 3. C-G含量测定 =0.100 x C-G +1.658三、核酸电泳（一）琼脂糖凝胶电泳1. 影响迁移率的主要因素: 核酸分子大小; 胶浓度（EB）; DNA的构象(超螺旋线型环状)核酸分子量标准:DNA/Hind

3、 III1 kb ladder2. 用途 常用于分析DNA（浓度、分子大小、分离） (分析RNA时必须加蛋白质变性剂) （二）聚丙烯酰胺凝胶电泳 适合小于1 kb 的DNA片段 适合RNA样品（三）脉冲场凝胶电泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE） 被分离的DNA可达10000 kb四、柱层析（一）羟基磷灰石柱层析 双链DNA与羟基磷灰石结合紧 结合变温可以按碱基组成分离DNA（二）亲和层析 oligo（dT）纤维素柱五、DNA的序列测定化学法（chemical cleavage method）Maxam & Gilbert（1977） 1. 首先用标记分子的一条链的一端； 2. 选择专一性试剂（针对四种碱基），分别对DNA降解，产生四套大小不等的放射性片段； 3. 对四套放射性片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离各片段； 4. 放射自显影观察放射性片段的位置； 5. 自下而上读出核苷酸顺序。 DNA序列测定酶法分离提纯DNA和RNA时分别应注意什麽？为什麽？核酸在 nm有特征吸收峰。核酸分子杂交， 核酸变性， 退火， Tm，限制性内切酶， 粘末端，平末端核酸只有在260nm才有吸收。（）可以用 判断核酸制品纯度。核

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