《基因组学》课件第9章 转基因动物-2015

1、第9章转基因动物技术及其应用郑州大学生命科学学院马珊珊一、转基因动物概述-基本概念 转基因动物(Transgenic Animal)是指通过实验方法，人工地把人们想要研究的动物基因或人类基因，或者是有经济价值的药物蛋白基因等（通称为外源基因）导入动物的受精卵（或早期胚胎细胞），使之与动物本身的基因组整合在一起，这样外源基因能随细胞的分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一代的一类动物。 （曾溢滔院士）遗传性动物基因工程：外源基因能够通过配子进行垂直传递并稳定遗传。非遗传性动物基因工程：转基因仅在当代表现，不能遗传给子代。一、转基因动物概述转基因动物和基因敲除动物的制作是动物基因工程最广泛和最有价值的应

2、用。 转基因动物是指用实验导入的方法将外源基因在染色体基因组内稳定整合并能稳定表达和遗传的一类动物（包括基因敲除的动物）。世界第一只转基因动物绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠HBV转基因动物树鼩1. 研究基因功能的最好模式。转基因动物过度表达某基因，研究过多的基因产物在生物体内的作用基因敲除动物抑制某基因的表达，研究没有某基因时，生物体出现的异常2. 建立多种疾病的动物模型，研究发病机理及治疗方法。如糖尿病小鼠，帕金森病模型小鼠，APP转基因小鼠，HBV转基因小鼠等3. 改善生物生产性能，提高生物育种效率。一、转基因动物概述why？4. 作为医用或食用蛋白的生物反应器。生物反应器是指利用转基因

3、活体动物的某种能够高效表达外源蛋白的器官或组织来进行工业化生产活性功能蛋白的技术。1）第一例显微注射法产生转基因小鼠 1980年，Gordon等把SV40 DNA显微注射到小鼠受精卵中，获得了两只转基因小鼠，创建了显微注射转基因方法。 二、转基因动物的发展和趋势2） “硕鼠” 1982年，Palmiter和Brinster用此方法把大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵，获得了“硕鼠”，首先证明外源基因可在受体中表达，并且表达产物具有生物活性。1. 转基因动物的发展历史3）转基因家畜的产生 转基因家兔、绵羊和猪(Hammer等，1985)、牛(Bondioli等，1988)和山羊(Ebert等，19

4、91)等相继出世。二、转基因动物的发展和趋势4)利用转基因生产重组蛋白 1987年，Simons等在转基因小鼠的乳汁中得到绵羊的-球蛋白，1988年，该研究小组又从转基因绵羊的乳汁中得到了-抗胰蛋白酶。 目前，已有多种蛋白实现了转基因生产。1. 转基因动物的发展历史正在进行转基因山羊的实验 乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊 上海交通大学医学遗传研究所转基因动物实例just a joke 二、转基因动物的发展和趋势2. 转基因动物的发展趋势从简单的显微注射法向高效的转基因体细胞核移植方向发展从外源基因随机插入或整合到定点整合的转变从传统转基因到条件控制的转变 目前转基因动物主要应用在:生物学

5、基础研究医学疾病模型动物生物反应器异种器官移植动物遗传改良二、转基因动物的发展和趋势 获取外源目的基因 重组载体导入生殖细胞或胚胎干细胞 选择体外培养系统和宿主动物 转基因胚胎的发育及鉴定 筛选所得的转基因动物三、转基因动物操作技术流程转基因动物的载体系统病毒载体系统非病毒载体系统腺病毒载体反转录病毒载体腺相关病毒载体单纯疱疹病毒载体慢病毒载体表达型质粒载体定向打靶载体随机基因敲除载体三、转基因动物操作技术流程病毒载体的不足：诱导机体的免疫反应，存在致毒、致癌的危险、载体容量有限、制备滴度不高等非病毒载体的优势： 1. 对DNA大小的限制较少，长达48kb的片段已被成功转移至细胞。2. 没有对

6、包装和复制所必需的病毒序列的要求，DNA易操纵3. DNA复合物不大可能有感染能力，比较安全。4. 关于免疫原性，存在问题较少。要求：1、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒 2、介导外源基因转移和表达 3、对机体不致病1、动物基因工程载体 之 病毒载体优点：1、利用感染性进入细胞，转导效率高； 2、复杂的装配过程由细胞完成； 3、不同的病毒载体具有不同的表达特点。三、转基因动物操作技术流程1)逆转录病毒载体1、动物基因工程载体 之 病毒载体三、转基因动物操作技术流程 逆转录病毒是单链RNA病毒，侵染细胞后表达出自身的反转录酶，以单链的RNA基因组为模板，立即在寄主细胞中反转录成线性双链DNA

7、，然后在整合酶（Int）介导下，整合到宿主基因组中（此时整合的病毒序列被称为前病毒），并在每次细胞分裂时，随宿主DNA一起复制。逆转录病毒的生活周期 进入宿主细胞 单链RNA 逆转录酶 双链DNA整合到宿主细胞基因组中（前病毒） 宿主细胞RNA聚合酶 RNA 病毒RNA基因组 作为合成相应病毒蛋白质的模版(mRNA) 包装成新的病毒颗粒，离开宿主 通常不致死宿主细胞特点：高效整合 外源DNA长度一般不应超过8kb逆转录病毒载体稳定、长期表达外源基因2)腺病毒载体1、动物基因工程载体 之 病毒载体三、转基因动物操作技术流程 腺病毒科为线状双链DNA病毒，分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。目前已鉴

8、定的人腺病毒有6个亚属，其中常用来构建载体的主要是C亚属的2型（Ad2）和5型（Ad5）病毒。 腺病毒感染人细胞时呈裂解型，不致癌；但对啮齿目动物来说，绝大多数的腺病毒成员均能致癌。宿主范围广，对人致病性低。在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因有效增殖，产生的病毒滴度高与人类基因同源，故一般用人类病毒做载体，人类细胞做宿主。不整合到染色体中，无插入致突变型。瞬时转染。能同时表达多个基因。腺病毒DNA载体的优点：转导效率高 体外实验通常接近100的转导效率 腺病毒DNA载体的特点：安全性能好 不整合人的染色体DNA，不会导致恶性肿瘤宿主范围广 对受体细胞是否处于分裂期要求不严格使用效果好 外源基因

9、在载体上容易高效表达 3)腺相关病毒载体（AAV）1、动物基因工程载体 之 病毒载体三、转基因动物操作技术流程 腺相关病毒是一种天然的复制缺陷型病毒，基因组为dsDNA，长约5k，复制需要有辅助病毒（如腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒等）的共转染。无辅助病毒时，基因组位点特异地整合入人19号染色体长臂。 非致病性、无免疫原性，85%的人呈血清抗体阳性， 但未发现其引起人类疾病； 能感染静止期的细胞；插入的外源基因表达时间长，可达1年； 宿主范围广 热稳定性强，可通过热灭活辅助病毒而得到纯化缺点： 外源基因的承载量只有4.7kb； 从包装细胞获得病毒颗粒的滴度较低，难以大规模培养腺相关病毒载体的特点常

10、用的病毒载体的特点： 原核复制区和选择标记 能在真核细胞表达的相关组件，如启动子、加尾信号、筛选标记等 附加元件，如增强子、内含子、剪接位点表达载体的共同特点:1、动物基因工程载体 之 质粒型表达载体三、转基因动物操作技术流程2、哺乳动物基因转移技术三、转基因动物操作技术流程物理转染法：化学转染法：生物法：电击法显微注射法基因枪法超声波法磷酸钙共沉淀法脂质体法DEAE-葡聚糖法聚阳离子-DMSO法病毒感染法细胞融合法 原理：在外加电场的作用下，细胞膜电位发生改变，细胞膜瞬间出现可逆性电穿孔，从而使一定数量的外源DNA从细胞外扩散到细胞质和细胞核内，并进一步整合到宿主DNA上，达到转基因目的。

11、特点：通用性强；可导入核酸、蛋白等；效率高；无毒性；操作简便，成本低；对于大片段转染效果较好；但细胞损伤大2、哺乳动物基因转移技术 之 电击法三、转基因动物操作技术流程 外源DNA在显微镜操作系统的辅助下，通过玻璃微管直接将外源DNA注入哺乳动物受精卵的原核内，使外源DNA整合到胚胎基因组中。然后再将受精卵植入假孕的动物体内，使其生长发育，制备转基因动物。 它是哺乳动物最常见的转基因方法，效果稳定，导入时不受DNA分子量的限制。但是，需要昂贵的设备和熟练的操作技术。2、哺乳动物基因转移技术 之 显微注射法三、转基因动物操作技术流程 将待转化的DNA溶解在磷酸钙缓冲液中，加入CaCl2溶液混匀，

12、DNA片段与磷酸钙共沉淀成大的颗粒；将上述制备的颗粒加入贴壁培养的细胞中，外源DNA就被靶细胞所吸收，实现转基因。细胞吞噬作用 适用于外源基因的瞬时表达，也可用于建立稳定表达的转基因细胞系。2、哺乳动物基因转移技术 之 磷酸钙共沉淀法三、转基因动物操作技术流程操作简便，成本低廉可大批量转染对细胞毒性较小效果稳定等转染效率较低，一般仅为104，对大片段（20kb）效果更差2、哺乳动物基因转移技术 之 磷酸钙共沉淀法三、转基因动物操作技术流程 脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹入内，形成DNA-脂复合物，同时也被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用

13、，将DNA传递进入细胞，进一步在核内转录表达。 这是目前应用最广泛的将外源DNA转入细胞的方法。2、哺乳动物基因转移技术 之 脂质体介导法三、转基因动物操作技术流程脂质体基因转移原理可生物降解无毒无免疫原性2、哺乳动物基因转移技术 之 DEAE-葡聚糖法三、转基因动物操作技术流程 二乙氨乙基葡聚糖（diethyl-aminoethyl-dextran），简称DEAE-葡聚糖，是一种高分子量的多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源DNA，机理可能是DEAE葡聚糖与细胞膜发生作用，使DNA更容易进入细胞，同时DNA与DEAE葡聚糖形成的复合物可以免受核酸酶的降解作用。 转染时，使DNA与DEA

14、E葡聚糖直接混合，形成DNA-DEAE葡聚糖复合物后，覆盖受体细胞。 操作简单，重复性高，转染效率高于磷酸钙法。 病毒DNA为载体可以将外源基因直接转染包装细胞系，获取具有感染性的重组DNA病毒载体后，感染特定的受体靶细胞。 这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导入效率高等优点，但也存在一定的风险，如在包装细胞系中与辅助病毒重组形成野生型病毒颗粒，引发生物安全问题。2、哺乳动物基因转移技术 之 病毒感染法三、转基因动物操作技术流程 受精卵雄原核显微注射法 胚胎干细胞（ES细胞）法 逆转录病毒感染法 体细胞核移植法 精子载体法3、转基因动物的制备三、转基因动物操作技术流程 以单细胞受精卵为靶细胞

15、，利用显微注射技术将构建好的载体DNA直接注射入受精卵的原核，再将接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育获得转基因动物个体。 目前应用较广泛，最早最经典的方法。3、转基因动物的制备 之 雄原核显微注射法三、转基因动物操作技术流程 线状分子整合率高于环状分子 显微注射后的受精卵移植成功率为10-30%，而未经注射的受精卵移植成功率达50-70%。 用显微注射方法制备转基因动物，操作技术性很强，即使是受过严格训练的专业人员操作，发育成转基因动物的受精卵也只占注射卵的5。 因此人们往往来用增大微注射受精卵的数目来弥补这一缺陷。 优点：外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；导入过程直观缺点：

16、设备昂贵、环节较多对操作人员有较高的技术要求低效率（尤其是大家畜）对卵伤害大，胚胎存活率低基因整合随机性转基因沉默胚胎干细胞（ES细胞）是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的全能细胞系。它本身是二倍体，能在体外培养；具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期胚胎内，可同宿主的内细胞团共同发育分化，产生嵌合体转基因动物。3、转基因动物的制备 之 胚胎干细胞法三、转基因动物操作技术流程胚胎干细胞基因转化法 (引自G1ick & Pasternak，1998) 将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成

17、高滴度病毒颗粒，人为感染着床前后的胚胎（也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共同培养以达到感染目的)，获得转基因动物的方法。3、转基因动物的制备 之 逆转录病毒感染法三、转基因动物操作技术流程 优点： 外源基因一般单拷贝整合 操作简单，避免注射法对卵子的损害 宿主范围广 缺点： 潜在致癌性,载体复杂 整合率不高,胚胎自我保护机制对其有抗性 逆转录病毒的序列可能干扰转基因表达3、转基因动物的制备 之 逆转录病毒感染法三、转基因动物操作技术流程 外源基因导入到体细胞中，用这种细胞的细胞核进行核移植（把体细胞核植入一个去了核的卵母细胞中），融合形成重构胚，激活胚胎发育，体外培养至囊胚其期，

18、植入同步化的代孕动物的输卵管。3、转基因动物的制备 之 体细胞核移植法 （转基因+克隆）三、转基因动物操作技术流程伊恩威尔马特永恒的多莉优点：转基因效率显著超过显微注射可以方便的建立生产畜群可以预测基因表达水平优点：对体细胞进行基因改造后，用于核移植可以提高转基因的效率，不仅具有“ES细胞途径”的全部优点，且物种适用面广。无需经过嵌合体育种就可获得纯合个体，周期短，效率高。缺点： 技术上难度大， 成功率极低， 胚胎死亡率高， 非一般实验室可以开展。方法显微注射核移植胚胎干细胞逆转录病毒优点外源基因整合效率较高，不需要载体，目的基因的长度可达100Kb转基因效率高；预测基因表达水平；可以使用定点

19、整合技术外源DNA的整合率高； 整合在生殖细胞中的比例也很高。 可在整合点整合转移基因的单个拷贝； 缺点精密仪器， 技术操作较难，易造成宿主动物基因组的插入突变供体细胞易衰老ES细胞株不易建立，长期培养后出现分化现象；生产的转基因动物都是嵌合体 插入的基因有大小限度；嵌合性很高；外源DNA 在动物各种组织中的分布不均 四、转基因动物的鉴定 PCR Southern杂交 报告基因 Northern杂交 RT-PCR FISH SDS Western杂交 目的蛋白生物活性检测鉴定表达水平检测1、制作转基因动物效率低 2、外源基因在宿主基因组中的行为难以控制 3、转基因表达水平低五、转基因动物研究出