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文档简介

1、哺乳动物细胞冷冻保存 哺乳动物细胞冷冻保存主要目的：（1）保存种子细胞，以便随时取用。这是保存细胞的最主要目的。（2）减少细胞被微生物污染的危险性。（3）减少细胞之间交叉污染的危险性。（4）减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变。（5）避免有限细胞系出现衰老或恶性转化。冷冻保存要点：（1）冷冻过程要缓慢。（2）冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90，无微生物污染。（3）细胞浓度控制在：11075107/ml。（4）使用高浓度血清或蛋白保护剂。一般情况下，用于冷冻保存完全细胞生长培养液中血清浓度大于20。（5）使用合适的细胞冷冻保护剂，以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏。 细胞冷冻保存液

2、主要成分：冷冻保护剂，血清或蛋白，基础培养液， 。 DMSO ：血清：1640 =1：2：7常用细胞冷冻保存液：（1）10DMSO 完全细胞生长培养液（20血清基础培养液）（2）10甘油 完全细胞生长培养液（20血清基础培养液），1:9(和生长液的比例）目前，最常用的冷冻保护剂是DMSO(二甲基亚砜)，使用终浓度为510。但是，有些细胞系不能用DMSO作为冷冻保护剂，如人白血病细胞系HL-60。因为，DMSO 能诱导HL-60 细胞分化。在这种情况下，可选用其它冷冻保护剂，如甘油（glycele）,羟乙基淀粉等。细胞冷冻保存操作程序： 传代后放入离心管的细胞悬液。离心1000rpm 10分钟。

3、 弃上清，加入保存液（ DMSO ：血清：1640 =1：2：7）（已备=1.8ml），混匀，移入冻存管，盖好盖，封口膜封口。需要冷冻保存的细胞先在4冰箱中放置3060 分钟；然后转入-20，放置30 分钟；然后再转入-80放置1618 小时（或过夜）；最后放入液氮中长期保存。有条件的地方，可用程控降温仪，按每分钟-1 到-3速度降温，一直到-80以下，然后直接放入液氮中长期保存。特别注意(1)：（1）细胞在冷冻过程中在-20冰箱内放置时间不可超过1 小时，以防止冰晶过大而破坏细胞。也可跳过-20这一步骤直接放入-80冰箱中，但这样做细胞存活率要低一些。（2）DMSO 稀释时会释放大量热量。因此，DMSO 不能直接加到细胞液中，必须事先配制。（3）DMSO 必须是细胞培养级别的。新买的DMSO 本身处于无菌状态，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管或瓶中，4保存。避免反复冻融造成DMSO 裂解产生有害物质。并可减少污染机会。如要过滤DMSO，必须选用耐DMSO 的尼龙滤膜。

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