《芯片原理与技术》课件第三章 蛋白质芯片-2

1、张彦婷郑州大学生命科学学院蛋白质芯片蛋白质芯片的制备蛋白质芯片的检测Liquichip液相蛋白芯片系统蛋白质芯片的应用蛋白质芯片蛋白质芯片应用最多的主要分两种方法蛋白质芯片的应用以标记为基础的方法以ELISA为基础的方法以标记为基础的方法样品用可以检测到的染料进行标记与蛋白质芯片反应被捕获的蛋白可以通过被标记有染料的物质检测出来蛋白质芯片的应用依赖于两种连接分子第一种：作为捕获分子第二种：作为检测分子样品与微阵列反应，通过捕获分子连接目的蛋白目的蛋白通过检测分子检测到捕获分子与检测分子连接在同一分子的不同抗原决定簇以ELISA为基础的方法蛋白质芯片的应用蛋白质芯片的应用蛋白质芯片应用蛋白质-D

2、NA相互作用蛋白质修饰蛋白质间相互作用蛋白差异表达分析小分子-蛋白质间相互作用抗体检测疾病诊断1. 双色蛋白质芯片直接用荧光素或生物素进行蛋白质的标记，样品与对照利用不同标记物标记蛋白差异表达分析例：抗体芯片筛选上皮性卵巢癌组织的差异表达蛋白蛋白差异表达分析例：抗体芯片筛选上皮性卵巢癌组织的差异表达蛋白目的：采用蛋白抗体芯片筛查上皮性卵巢癌的差异表达蛋白样品：选取11例卵巢上皮性癌混合样品及其配对的正常卵巢组织混合样品, 经Cy3和Cy5双色荧光标记反应：与含有 512 种已知蛋白质的单克隆抗体芯片杂交蛋白差异表达分析蛋白差异表达分析蛋白差异表达分析结果：共发现31个差异明显的蛋白质, 其中在

3、卵巢癌中高表达的蛋白质有17个, 在卵巢癌中低表达的蛋白质有14个蛋白差异表达分析结论：发现多数差异表达的蛋白质参与细胞的转录、增殖、信号传导和细胞凋亡等重要的生物过程,称之谓“关键蛋白群”蛋白差异表达分析2. 夹心ELISA法检测蛋白质表达基本原理：两种抗体检测 一种蛋白质优点：易于操作缺点：很难开发成为一种高 密度的蛋白质芯片蛋白差异表达分析例：抗体蛋白质芯片检测卵巢癌耐药细胞株细胞因子改变的研究例：抗体蛋白质芯片检测卵巢癌耐药细胞株细胞因子改变的研究实验：对 6 株卵巢癌细胞进行耐药性研究及细胞因子抗体蛋白质芯片检测,同时筛选78种细胞因子的表达差异目的：初步筛选出与卵巢癌耐药发生有关的

4、多种细胞因子肿瘤标志物蛋白差异表达分析芯片：细胞因子抗体蛋白质芯片（RayBiotech）样品：卵巢癌细胞系6株检测试剂：生物素结合的抗体反应：室温孵育检测：加生物素结合的抗体，过夜，加辣根过氧化物酶结合的链霉亲和素，进行化学发光检测数据分析蛋白差异表达分析结论：在常见分泌型细胞因子中, GRO, IL-6 , IL-8和TIMP-2升高与一线化疗药ADM和CBPDA耐药性相关, IL- 6, IL- 8与二线化疗药TAXOL, VP16 耐药性相关蛋白质芯片的应用蛋白质芯片应用蛋白质-DNA相互作用蛋白质修饰蛋白质间相互作用蛋白差异表达分析小分子-蛋白质间相互作用抗体检测疾病诊断蛋白质相互作

5、用关键是获得重组蛋白以及纯化蛋白例：酵母蛋白质组芯片Zhu等克隆了5800个酵母基因，进行过量表达及蛋白纯化高密度地点印到载玻片上制成酵母蛋白质芯片方法一：蛋白质芯片检测蛋白-蛋白和蛋白-脂质相互作用蛋白质相互作用缺陷：重组蛋白的制备和纯化蛋白质标记后可能影响其空间构象膜结合蛋白或有毒蛋白难以表达蛋白质相互作用方法二：抗体芯片蛋白质相互作用方法三：蛋白质结构域或基序芯片鉴定可能存在的蛋白质相互作用结构域或基序例：Espejo等制备的蛋白质-结构域芯片包括与蛋白质间相互作用的三级结构组件，如WW、SH3、SH2、FHA、PDZ、FF结构域将蛋白与芯片反应用特殊的抗体进行检测蛋白质相互作用蛋白质相

6、互作用用此芯片，研究了信号分子Sam68和SmB的结构域连接图谱蛋白质相互作用蛋白质芯片的应用蛋白质芯片应用蛋白质-DNA相互作用蛋白质修饰蛋白质间相互作用蛋白差异表达分析小分子-蛋白质间相互作用抗体检测疾病诊断蛋白质修饰研究策略主要有标记底物、修饰型抗体和激酶底物等1. 标记底物：被标记的底物在修饰发生时被搀入到蛋白质中例：Zhu等建立酵母蛋白质激酶芯片重组表达119种蛋白激酶，构建蛋白质芯片，研究蛋白激酶与底物的反应2. 激酶底物蛋白质修饰捕获分子的制备芯片制备蛋白质修饰蛋白质修饰用17种不同的底物进行检测发现了许多蛋白激酶的新特性蛋白质修饰3. 修饰型抗体：修饰的蛋白能被修饰型抗体检测出

7、来蛋白质修饰蛋白质芯片的应用蛋白质芯片应用蛋白质-DNA相互作用蛋白质修饰蛋白质间相互作用蛋白差异表达分析小分子-蛋白质间相互作用抗体检测疾病诊断蛋白质-DNA相互作用两种方法：蛋白质芯片、DNA芯片1. 蛋白质芯片蛋白质芯片与标记的双链DNA探针反应，快速鉴定出与DNA具有相互作用的蛋白质2. DNA芯片建立双链寡核苷酸芯片，研究DNA结合蛋白的特性与鉴定Bulyk等制备DNA双链寡核苷酸芯片检测蛋白质与DNA相互作用蛋白质-DNA相互作用Panomics公司开发的转录信号蛋白质/DNA微阵列细胞核提取物用磁珠进行标记与生物素标记的多种保守转录因子结合序列共同温育结合的双链寡核苷酸与蛋白质共

8、沉淀除去蛋白质与寡核苷酸芯片杂交蛋白质-DNA相互作用蛋白质芯片的应用蛋白质芯片应用蛋白质-DNA相互作用蛋白质修饰蛋白质间相互作用蛋白差异表达分析小分子-蛋白质间相互作用抗体检测疾病诊断小分子-蛋白质相互作用鉴定小分子-蛋白质之间的相互作用，是新药发现的一个主要途径蛋白质芯片适用于筛选药物作用靶标1. 将小分子固化在芯片上，与标记的蛋白共同孵育2. 应用标记的小分子去筛选蛋白质芯片上的蛋白质蛋白质芯片的应用蛋白质芯片应用蛋白质-DNA相互作用蛋白质修饰蛋白质间相互作用蛋白差异表达分析小分子-蛋白质间相互作用抗体检测疾病诊断抗体检测同一物种的不同抗体在mRNA序列上有相似性以蛋白质为基础的技术能有效检测抗体例：针对风疹、麻疹、流行性乙型脑炎3种病毒建立能同时1次检测3种病毒IgM抗体的蛋白质芯片抗体检测蛋白质芯片的应用蛋白质芯片应用蛋白质-DNA相互作用蛋白质修饰蛋白质间相互作用蛋白差异表达分析小分子-蛋白质间相互作用抗体检测疾病诊断疾病诊断可进行多种抗体检测 检测多种肿瘤标志物例：自身免疫性疾病抗体检测芯片 可同时检测多种抗原特异性抗体定量检测组织提取液中的肿瘤标记物Weissenstein U, Proteomics 2006, 6, 14271436.孵