陈念-《非水短肽合成》(共16页)

1、Review : Proteinase Catalysed Short-Peptides Synthesis（2ed.）2002 Jie, Biochemistry and Molecular Biology Department, Life Science College , Southern China Agriculature University ,(Guided Teacher: Xiang Yang.Gao , Editor: Nian Chen) Content1.Preclude1.1.The significances of short peptide synthesis 1

2、.2.The excellence and shortcomings of enzyme-catalyzed synthesis compared with other synthesis methods 2. The mechanisms of enzyme-catalyzed peptides synthensis in organic solvent3.The influencing factors3.1.Factors of the enzyme3.1.1Preparation3.1.2The pH and the ion strength of the buffer3.2Carrie

3、r3.2.1The methods of the enzyme-immobiliation 3.3Modification3.3.1Modification of the enzyme3.4The solvent system3.4.1The characters of the solvent system3.5The characters of the reactant and the offspring3.5.1. The solubility and concentration of the reactants3.5.2. The water content and activity 3

4、.5.3.The hydrophobility of the protecting groups3.6.Other factors3.6.1.Temperature3.6.2.Salts added into the reaction system 3.6.3 Polarity additives4. Summary4.1Key problems need to be solved in the peptide sythensis 5. Accessary tables5.1.The collections of the examples about short peptide synthes

5、is5.2.LogP datas of some organic media 5.3.LogP datas of some enayme carrier 6.Postscripts蛋白水解酶催化(cu hu)短肽合成研究综述（第二版） 华南农业大学生命科学学院(xuyun)2002届生物化学与分子生物学专业 （作者(zuzh)： 陈 念 指导老师：高 向 阳）一前 言肽合成的意义1.现代生物代谢研究发现：人类摄取蛋白质经消化道的多种酶水解后，并非完全以氨基酸的形式吸收，更多是以低肽形式直接吸收，而且二肽三肽的吸收比同一组成的氨基酸快。其中某些低肽不仅能提供人体生长发育所需的营养物质，且同时具有

6、促进矿质吸收、提高肌体免疫力等重要的生理功能。2.生物活性肽是一类多功能因子，它们涉及许多生理代谢和调节功能。日本利用生物活性肽以开发出许多功能性食品，取得了良好的经济和社会效益。（二）相对其它方法酶法肽合成的优、缺点1.(居乃虎)酶反应通常是在水为介质的系统中进行的，但是，人们研究发现，在有机介质中酶反应也能进行。近来，核磁共振、X-射线衍射和傅立叶变换红外光谱的研究表明，在非水相中，酶分子结构中-螺旋含量减少，-折叠含量增加二级结构的有序性增加，因而，提高了酶的稳定性。目前，非水系统中的酶催化作用已广泛的用于药物、生物大分子、肽类、手性化合物化学中间体和非天然产物等的有机合成，引起人们的极

7、大关注。2有机介质中的酶促反应（尤其是合成只含几个氨基酸的小肽片段）较传统化学合成法有明显优势：a能催化水中不能进行的反应，可以使反应平衡由水解向肽合成方向逆转b酶的立体专一性强，避免了化学法合成中产物的消旋问题c较少用侧链保护基；可抑制由水等引起的副反应（例如水会使酶分子形成不规则结构、二硫键被破坏、Asp肽键水解、Asn和Gln残基脱酰胺、酰卤和酸酐水解）；且无微生物污染d可提高疏水性底物（氨基酸及脂类衍生物）的溶解度，利于高浓度底物连续生物转化e 酶源广泛，也可通过微生物发酵生产制备大量的酶f固定化可以提高酶的稳定性g酶不易溶于有机介质利于回收再利用；而且从低沸点溶剂中分离纯化产物也比水

8、中容易 h 酶能合成或转化大量有机物，绝大多数有机化合物在非水系统中溶解度高i酶反应条件温和，可催化很多对酸、碱敏感的分子参加的反应3.亲水氨基酸在有机溶剂中溶解度小，而且多数蛋白酶不能以D型氨基酸为底物，故在方法上含上述两种氨基酸的肽的合成有待改进。有机溶剂中脂肪酶也有合成肽键(ti jin)的功能，而且其无酰胺酶活性，肽的水解被抑制，这对寡肽合成有利，而蛋白酶相对来说稳定性较差，而且水的存在可能使肽降解（此处来源待查文献1125/26）。二酶有机(yuj)相催化肽合成的机理1.从宏观分析：一些蛋白解酶、羧酸脂酶在有机溶剂中底物专一性完全逆转(nzhun)，原因在于越亲水的底物与水形成的氢键

9、越强，从而不利于酶底物络合物的形成，使得在水中，氨基酸优先与水形成亲键；在有机溶剂中，则是氨基酸优先与酶结合。2.Klibanov（1977）以及Martinek对有机介质中酶促合成机理进行过详细的讨论。认为有机相和水相的体积比（）以及反应底产物在两相中的分配系数（Pi）决定了水-有机溶剂体系和单一水相中酶促肽合成的有效平衡常数的比值（K/Kw）。在一般两相体系中，可以假设和Pi约等于100，则可以推导出（公式见文献1）K2500Kw，这从理论上解释了为什么蛋白水解酶在有机溶剂中会催化肽合成反应。3.水解反应是合成肽的竞争性反应，水解反应强弱直接影响肽合成产率。在有机介质中合成小肽的关键问题是

10、在实践中如何提高肽产物收率。目前，酶合成多肽较常采用的方法有两种：（1）通过热力学控制的平衡合成（特点：通过控制温度、有机辅助溶剂、形成不溶产物改变反应平衡，速度较慢）。在热力学控制的肽合成中，最佳pH相对较低，这是因为在pH提高使非质子化亲核体浓度增加的同时羧基组分的离子化程度也会增加，两者相互平衡的结果使pH不可能太高。（Blanco R M文献2312）（2）通过动力学控制的非平衡合成，首先是N-保护的氨基酸酯与酶快速反应形成活泼的酰基化酶中间体，此中间体迅速与亲核试剂（氨基酸酯或氨基酸酰胺）进行转酯化反应生成肽。在动力学控制的肽合成中，进攻酰化酶中间体的亲核体一般不带电荷，当溶液pH高

11、于亲核体pKb两个单位时，亲核体会有98去质子化，利于平衡向肽键形成反向移动。然而pH值过高，OH浓度增加又会导致水解反应发生。（Wilson S A文献2315）三影响酶（木瓜蛋白酶）有机相催化肽合成的因素A酶本身酶的制备1. Noritomi H在有机溶剂中，酶活也是制备方法的函数，制备方法还会影响酶的其它催化性质。这是因为蛋白质脱水冻干后构象会发生不可逆变化，制备方法不同会形成不同的构象。2. Zaks A.发现酶在有机溶剂中能保持酶冻干前一定pH和离子强度缓冲液的构象，两者最适pH一致，这称为酶的“记忆”功能。因此可以通过在酶冻干前加入底物类似物等配体可将酶的催化构象“锁住”，使之高活

12、性构象形式在有机溶剂中得以保持，以增加酶的活力，这种技术称为分子印迹（molecular imprinting）。在水溶液中，这种印迹则容易失去。K Dabulis .研究了四种蛋白酶和三种脂肪酶发现，酶与配体共存的水溶液经冷冻干燥，比没有配体的活力大大提高。配体是指酶的抑制剂或抑制剂类似物，另外一些冷冻干燥剂(lyoprotectants)(如PEG、山梨醇、甘露醇、海藻糖)和附形剂（excipient）也可以起到类似作用。生物印迹的修饰方法(待查！参见文献3514、15、16)。3.（文献3517）Okahata 还发现印迹可以(ky)提高脂肪酶在无水异辛烷中催化苯乙醇和月桂酸的酯化反应的

13、对映体选择性。4.因此，制备(zhbi)酶时应使用具有最适pH和离子强度的缓冲溶液溶解在冷冻干燥，以保证有机溶剂中酶的微环境具有最适pH值。5.在制备酶的过程(guchng)中，还应注意一些问题：所使用的酶尽可能纯化，以减少杂质干扰，提高重复性；酶的反应活性与立体选择性受制备过程中酶颗粒聚结的影响很大。如果先把纯化过的酶溶解于缓冲溶液中，然后再加入有机溶剂，酶不易聚结分散性较好；控制酶的颗粒大小，颗粒小可以增大酶与有机溶剂的界面，提高反应速度。6.（文献1918）Fabur K发现，同一种脂肪酶，即使不同的来源对pH的敏感程度也不同。 7.（文献717）加酶量对反应速率也会有影响（二）缓冲液p

14、H和离子强度1.缓冲液有三个重要因子：pH、缓冲液类型（注意！）、缓冲液用量（待查，文献3316）。2.在冻干前，用缓冲液调pH值对提高酶活有一定作用，但复杂的反应体系影响会造成蛋白质表面的电荷重新分布，如酸碱参加的反应。由于体系中有机相占绝大多数，故直接测定pH值会很困难。3.由于酶活性基团的离子化状态与活力关系密切，（待查，文献3318）用有机相缓冲液（氨基酸氨基酸氯盐对）控制低水有机介质中的酸碱条件，通过影响酶分子离子化状态来影响酶活。4.酶催化反应的最适缓冲液pH值和离子强度除与酶本身来源和底物的pK影响，还与载体带电性质有关。Zhang利用固定化木瓜蛋白酶合成各种二肽时发现，不带电荷

15、的载体适于较低的离子强度，而带电荷的载体则需较高离子强度。B载体（三）酶的固定化载体和方法1.在生物体物质的转化中，许多酶是以与膜结合的状态行使功能的，如催化亲酯性化合物转化的酶，此类酶从膜中释放出来后稳定性降低。尽管可以使用酶粉作催化剂，但效果并不好，原因在于天然酶在有机溶剂中易失活，且酶粉的分散性差，易聚结成团。在酶浓度高时会出现自溶现象和不易分离的缺点。酶粉不利于底物和酶分子间的质量扩散。固定化酶则不仅简化了纯化工艺 ，利于酶的回收和连续化生产。还可用于多酶反应体系。固定化酶有利于提高其在有机溶剂中的扩散效果和热力学稳定性，固定化还有利于把反应器设计成大规模的连续反应的填充床反应器。2.

16、有机相中载体选择与水相中的不同在于需满足(mnz)酶在有机相反应时的最适微水环境、稳定性及扩散。载体与溶剂间极性相差越大，酶越不易暴露于有机溶剂，因而失活的可能性越小。Reslow et al提出了LogAq值（分配(fnpi)到载体和溶剂中的水量之比）代表载体的亲水性大小，发现亲水性强的载体不利于酶活力提高。即使向亲水性强的载体中加水也不足以达到低亲水载体的反应速率。Adlerereutz(文献345)的试验也发现载体亲水性强的不利于酶活力提高。3.（李继衍详见文献46）所述工业上常用的四种(s zhn)固定化方法及常用的酶的形状固定化生物催化剂的物理形状：根据底产物性质和酶的反应特点及所用

17、反应器类型的差异，需采用不同物理形状的生物催化剂。有膜、片、块、纤维、珠、管、微囊等形状。而且同一材料可以制成不同的催化剂。其中膜载体具有组装连续运转生物反应器的优势。4.常见的固定化方法有：从原则上讲，载体结合法、交联法、包埋法均可用于有机溶剂中催化，但使用较多的使载体吸附法(酶)和凝胶包埋法（细胞）。（李彦锋文献31）工业上酶的四种固定化方法及特点 ：a包埋法：分为网格型和微囊型两类，其制备工艺简便且条件温和，可以获得较高的酶活力回收。但高分子凝胶或半透膜的分子尺寸选择性不利于大分子底物和产物的扩散b交联法（架桥法）：将酶的氨基酸残基与交联剂反应而被固定化，可得酶蛋白单位浓度较高的固定化酶

18、。但酶活损失大。c吸附法：包括物理吸附和离子结合法，工艺简便而且条件温和酶活损失小固定化和纯化可以同时实现。但酶易脱落。d共价结合法：稳定性和重复性高，是目前研究最为活跃的一种方法。酶活损失大。共价结合固定化酶较牢固，尤其是多点共价结合在高度活化的载体上的稳定性更强，适于工业上较激烈的反应条件。但共价结合时，酶活损失较大，而且有时需引入手臂活化，避免载体对底物的空间阻碍。 5.载体对酶催化反应的影响有以下几个方面:a酶固定在载体上，保护了酶的水化层，稳定了酶的催化构象，从而提高了对有机溶剂的抗性。Sergeeva M V发现酶与载体结合的键越多，酶稳定性越高。b载体LogAq值影响底产物在酶微

19、环境中的局部浓度。对于疏（亲）水性底物，载体疏水性越强（弱）酶反应速度越快。原因在于与载体亲疏水性相差较大的底物由溶剂向酶微水相扩散的阻力也较大。载体的这种性质对受底产物抑制的酶影响较大。c载体对酶的动力学有直接影响。即使在酶水合程度一定的条件下，反应的速率也会因载体的不同而有很大差别，可以相差一个数量级。d酶固定后会部分失活，加入蛋白质和PEG会减弱酶的失活。6.用于有机介质固定化常见的载体有：硅胶、硅藻土、玻璃珠、纤维素、微孔陶瓷、凝胶、树脂。载体的选择在酶的固定化方面具有相当重要的地位，在选择载体时应考虑的因素有：a首先要考虑载体的表面性质，共价结合时有可活化的基团，酶是否可以吸附在其表

20、面上，载体上是否含有可以固定化的基团，是否要对载体进行化学修饰等。b载体应具有一定的亲水性。亲水性较低的载体（如硅藻土）酶活较高，这是由载体与酶之间对水的竞争造成的。在低水含量的有机溶剂中酶的必需水易被亲水性强的有机溶剂剥夺；在含水量较多的溶剂中，亲水性强的载体会使酶分子活性中心完全被水包围，酰化酶中间体易水解。提高载体疏水基的含量可以提高酶对疏水底物的催化活性。c载体的选择是控制酶催化中底、产物浓度的一个有效方法，提高载体疏水基含量可以提高催化剂对疏水底物的活性。d载体应具有良好的稳定性，对酸碱有一定的耐受性；有一定的疏松网状结构及机械强度，颗粒均匀；可耐受酶及微生物的作用，不致引起变性；廉

21、价易得。e载体酸碱性强弱也会影响酶的催化活性（文献234Nilson K. 23XING Guo-Wen），阳/阴离子交换树脂导致最适pH偏低/高（文献2315Wilson S.A.）f载体孔径与颗粒大小也可能会对反应产生影响。孔径小、颗粒大的载体易产生较强的传质限制（mass transfer limitation）对酰基供体、亲核体选择性、以及立体选择性都会产生影响。此外，还应考虑的因素有载体上酶的负载量、载体表面积。g适当的选择载体能提高酶的选择性。例如把-胰凝乳蛋白酶固定在含葡萄糖的微孔玻璃上有利于水解反应，而在含已烷基的微孔玻璃上有利于醇解反应。h要综合各种因素选择最佳载体。蔡谨研究

22、了几种载体对酶固定化的影响，结构发现，壳聚糖固定化酶的相对比活较高，但其吸附量太小，综合比较异硅藻土为优。C修饰(xish) （四）酶的化学修饰1.有机相酶催化反应酶的利用形式一般有三种：酶粉、修饰酶、固定化酶。双亲分子(fnz)PEG共价修饰或二烷基型脂质非共价修饰酶分子表面，可以增加酶分子表面疏水性而均一的溶于有机溶剂。PEG长链共价结合到酶表面的Lys残基上，在酶周围形成一个水化层，避免了溶剂与酶的直接作用，Yoshimoto（文献1214）用这种方法(fngf)制备了在有机溶剂(如苯、氯仿)中完全可溶的酶。Takahashi（文献1215）只要为酶的水合提供适量的水，PEG修饰酶在有机

23、溶剂中就能保持一定的活性。2. G.Ottolina. et al研究了脂蛋白脂酶以酶粉、PEG修饰酶（又分三种）、硅藻土吸附酶不同的形式加入甲苯中其酶活的变化。发现酶的形式对活性有极大的影响。D溶剂反应体系内的性质（五）溶剂性质1.按催化介质的不同对反应体系进行分类，有以下几种：无 溶 剂体 系低共溶多相混合体系（详见文献92426）（Heterogeneous eutectic mixtures） 溶剂体系有水溶剂体系纯水溶剂单一的水相体系，产物以沉淀形式析出，但水解副反应竞争强烈，酶用量相对较多，产物覆盖在酶周围造成扩散限制，因此在工业上应用受到限制。但Haensler报道通过冷冻反应体

24、系可以抑制副反应。在水相中加入盐、聚醇、糖也可以降低水解活性。单相体系单相共溶剂体系：采用与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇、丁二醇、丙酮、乙腈（jing）、二甲亚砜（DMSO）、DMF、THF、二甲替甲酰胺、二氧六环等)。若同时加入甘油等多元醇可通过减少水活度增加酶的稳定性。Lozano P（详见参考文献2316）在一般情况下，肽收率在一定范围内随有机溶剂浓度的增加而增加，而且有机溶剂亲水性愈强最佳浓度愈大，酶催化活性愈高。相对两相体系来说由于酶与有机溶剂接触面积大更易使酶失活。两相体系一般两相体系：采用与水不互溶的有机溶剂（如脂肪醇、丙醇；酯、乙酸乙酯；乙醚、二异丙基醚；氯代烷烃、二氯甲烷、

25、三氯甲烷、氯仿；烃类、环己烷、异辛烷）时，一般也是疏水强的有机溶剂有利于酶活。这种体系适于水溶性差的底物（如固醇、脂肪），底物不断从有机相进入水相，产物不断从有机相中析出。特点：体系易构建，产物易与酶分离，避免了水解反应和产物抑制。但该体系在塔式体系中会出现沟流，在工业应用上有一定难度。低水溶剂体系Microaqueous media（如正己烷、环己烷、二氧杂环己烷、辛烷、氯仿、苯等脂肪烃和芳香烃）。相对来说，低水溶剂体系对有机合成特别有利，因为产物的回收和酶的重复使用特别容易。优点：易构建，特别适于非常疏水的溶剂体系，适于较高温度的反应。混合有机溶剂体系（文献2318、19）三相体系反相胶束

26、体系（reversed micelles）（文献5）优点：胶团内部为酶催化提供最佳微环境，胶团体系是透明的和热力学上稳定的，方便用光学方法跟踪酶反应进程，适于疏水化合物的酶促合成和转换。非水体系均 相体 系超临界流体（参见相关文献,很多！）2.从宏观上看，有机溶剂的极性是对酶活最主要的影响(yngxing)因素：Laane用LogP（一种(y zhn)有机溶剂在正辛醇-水两相溶液中分配系数的对数）作为衡量有机溶剂极性的指标，研究100多种溶剂的LogP值与酶活的关系后发现LogP4时是理想(lxing)的介质，LogP2则极性太强，并指出在常用有机有机中只有约1/5可用于酶促反应。3.但也有不

27、少例外的情况，说明LogP并非选择溶剂的唯一标准。（参见Clapes文献1712）。参见文献338、9、19的观点。同时参见（文献344）也有例外的情况，即溶剂的亲疏水性不仅影响酶分子表面必须水的多少，同时也通过影响溶剂在必须水中的浓度间接影响酶活。而两者随溶剂亲疏水性变化对酶活的最终影响是相反的。4 .Gololobov M Y认为在酶促合成肽反应中，对不同的酶来说适宜的有机溶剂体系是不同的。改变有机溶剂的类型，不同酶反应速度可能朝相反方向变化，说明不同酶在催化中与有机溶剂作用的反应机理不同。5. 溶剂影响酶活性的机理：a酶的几个不可逆失活过程（脱氨基、水解、胱氨酸分解）都需要水。有机溶剂中

28、此类反应影响较小，使得酶的稳定性提高b夺走吸附在酶分子上的水份，或者在两相界面直接与酶（活性中心）接触而使酶失活。 c 溶剂改变底物或酶底物复合物的能级从而改变酶反应的活化能d溶剂直接与底、产物分子发生反应或影响其在水相和有机相中的分配而改变其在酶分子表层中的浓度（这对受底、产物抑制的酶尤为重要）e有机溶剂还可通过影响底、产物的扩散从而影响酶活。6. 选择(xunz)溶剂时应注意：a溶剂对反应是惰性的。例如，醇与酯间的酰基转移反应，不能用醇或酯作为溶剂。b溶剂对底、产物溶解性好，利于其扩散c 一般说来，亲（疏）水性底物选择疏（亲）水性溶剂进行反应，这可能是由底物在酶的微环境和溶剂间分配不同造成

29、的d亲水底物在疏水性较强的溶剂中易进入酶的疏水袋，因此亲（疏）水性底物应选择疏水性较强（弱）的溶剂。但考虑到亲水性氨基酸底物在疏水性有机溶剂中溶解度很低。例如，酶催化糖修饰反应必须在亲水性与水互溶的溶剂中进行，否则底物不会溶解，酶促反应不能发生。（注意！有点矛盾）e产物与溶剂的互溶性也很重要，极性产物长分散在酶的周围，造成抑制作用。例如，Fitzpatrick.P.A. et al.催化多酚氧化的反应，产物醌在正己烷中不溶并在酶周围的水层中发生聚合（酶表观失活），而以氯仿作溶剂时，醌易分配到溶剂中，故酶不失活。溶剂还会影响酶的对映体选择性。f溶剂的毒性、成本、密度、粘度、表面张力、废物的处理及

30、产物从溶剂中分离的难易。7.仿水溶剂 Kitaguchi.H et al.研究(ynji)嗜热杆菌蛋白酶合成肽。仿水溶剂（water-mimicking solvent）甲酰胺、二甲基甲酰胺（DMF）、乙二醇、甘油、四氢呋喃可与酶分子形成氢键，起到一定的调节酶活性与选择性的作用，尤其是对水特别敏感(mngn)的肽合成反应。（六）体系水含量与水活度1.水是影响酶稳定性和对映体选择性的重要因素之一。研究非水相酶促反应中的水作用，常使用体系最佳加水量、酶分子表面必需水含量、水活度三个参数。一般说来，在有机溶剂中随着水含量增加酶稳定性减弱，而减小水的活度有利于肽键的生成。2.是，各种水活度的测定故方法

31、均容易产生较大的误差，原因在于：a在反应体系中水分子通过扩散达到平衡状态是一个动态的过程，很容易受到反应体系的影响而发生变化。通常假设水在反应体系中很快达到平衡：在混合体系中，Rupiey J A(文献349)水的分散过程只是在近距离的移动和分散；而在非混合体系中，由于蛋白质的水合作用具有明显的滞后性水的分配在短时间很难达到平衡。b在处理样品时不可避免的水份的挥发和吸附在容器的器壁上，使水份很容易重新进行二次分配。5.水活度的控制：虽然水活度不容易精确测定，但是，在有机相反应中连续控制水活度可以提高反应产率和反应速率。有关控制方法的报道如下：a Halling(文献3415)加入具有缓冲作用的

32、水合盐的方法，由于不同水合盐代表不同的水活度，故只要向反应体系中加入不同水合盐（常为0.2g/ml）就可以产生不同的水活度。b Kvittingen L.et al.（1992）常见的获得恒定水活度的方法是向干燥的反应混合物中加入一种盐的高水合物(NaSO4/ NaSO410H2O)，是一种很好的水活度缓冲剂。但是水合盐可能会对酶活产生影响（文献343）。c （注意文献6中14相关叙述！也见文献1913）对于酯合成和肽键形成的反应，体系中水的积累会降低酶活性，在体系中加入乙基纤维素、分子筛可以有效去除多余水份。E底产物(chnw)性质（七）底物(d w)的溶解性和浓度等性质1.（内容不够，要扩

33、展一下！）在实践中常见难题是解决极性亲水氨基酸在有机溶剂中溶解度的问题(wnt)，加水固然可提高其溶解度，但同时也促进平衡向肽链水解方向移动。通过对极性底物进行化学修饰来增加溶解度或与极性组分混合来克服这一困难。2.一般情况，增加底物浓度可以提高产率，有时还可以达到定量转化并且简化分离纯化步骤。热力学控制的肽合成，酰基供体的羧基为游离态，过量加入底物会使pH变化而影响产率。过量加入溶解性不好的底物会引起底物扩散限制（文献2328）。此外，当酰基组分浓度达到饱和时，浓度继续增加不影响产率（文献2312）。3.酰基供体结构以及保护基对固定化酶合成多肽也有影响（也要扩展以下！文献237、26）。（八

34、）底物保护基的疏水性1.（比较重要，可能要扩展以下！文献916）Calvet S.在研究形成肽键的反应中发现，底物保护基的疏水性不同对酶促反应有很大影响。作者认为在水介质中，作为酶与底物结合动力的疏水相互作用起主要作用，因而将疏水性的保护基底物反应的产率会更高。而在有机溶剂体系中，底物与溶剂间的静电作用变为主要作用，故以亲水性强、偶极距大的保护基氨基酸酯为底物是，反应速度较快。F体系外环境因素及一些非主流因素（九）温度1.提高温度通常会增加反应速度，但过高会使酶失活变性。有报道在低温下酶促肽合成有较好的收率（见文献23中相关的两个例子4、13）2.（扩展？文献346）尽管温度影响可使酶在己烷中

35、的浓度显著增加，但是酶的最佳结合水量几乎与温度无关。（十）非缓冲体系的盐类1. Khmelnitsky Y L and. Dordick和Ru. et al.等发现将枯草杆菌蛋白酶和-胰凝乳蛋白酶溶在含有98（w/w）的KCl的磷酸盐缓冲液中冻干在正己烷中催化转酯反应活力大大提高，其Kcat/Km值比无KCl存在时高3750倍。KCl在很多溶剂如异丙醚、四氢呋喃、CH3CN、丙酮、二噁烷、甲苯中有类似的效果。提高的原因是反应平衡常数Kcat的增加，而不是Km降低（酶与底物的亲和力）。2. Michael et al同样(tngyng)用枯草杆菌蛋白酶在正己烷中转酯化反应，盐诱导(yudo)使K

36、cat/Km值提高(t go)可达2万倍。认为盐的结合和冷冻干燥的时间和水含量共同起作用。酶活性随冷冻干燥时间增加而增加，水含量低于最适含量则迅速降低。 3.盐只有当它与酶紧密结合时才会有促进酶活的效果，如果不将盐固定到酶分子内部去则无效。可能的原因：盐能保护酶免受有机溶剂对它的直接失活作用；盐基质是高度极性的能帮助维护酶的天然结构不受冷冻过程的破坏。研究盐对酶活的影响对降低固定化成本有不可估量的潜在价值。 (十一)极性添加剂1.（详见文献19最后7、20）极性添加剂是指乙二醇、丙三醇及酰胺、N，N-二甲基甲酰胺等极性分子，适当加入可以影响酶的活性和立体选择性。（文献192、6、21）Gorm

37、an等人的试验表明：少量的极性添加剂可以使酶上的水转入主体溶剂中；同时还可以使体系中水的活度下降。2.极性添加剂对体系的影响可能在于以下方面：a影响反应体系内水的分配b与酶蛋白直接作用而影响其构型c通过改变疏水主体溶剂的极性从而改变酶周围的微环境的极性，影响底产物分配。四总结研究中需要解决的关键问题1.由于生物反应体系本身的复杂性，有机相酶催化理论尚不完善:a将有机溶剂对酶催化活性的影响进行定量描述，达到能够准确预测某一给定的有机溶剂对酶催化活性和底物专一性的影响。 b改善酶与有机溶剂的不相溶性，机械方法不可能使酶在溶剂中达到分子水平的分散，这样测出的只是表层分子的酶活，或者说是在严重内扩散影

38、响下所表现的活性。将酶固定于表面很大的支持物表面可最大于溶剂的接触机会，为其工业化应用所必需。将酶用PEG修饰已成为生物工程领域的热门课题，其在有机相酶催化中的应用也有报道Inada Y、Clark D。c研究有机相中更广泛的酶类和多酶体系，目前研究较多的是水解酶类中的脂肪酶、蛋白酶和脂酶，因为水解酶无需辅因子且价格相对便宜。基因工程的发展使微生物产酶量及活性有很大提高，为研究更广泛的酶类的有机相催化性质创造了条件。d采用底物活度进行酶催化动力学研究，在稀水溶剂体系中由于底物分布相对均匀，可近似用浓度代替活度进行研究而在有机相酶催化这样的多相体系中，其分布的非理想性不再很小，因此用底物活度代替

39、其摩尔浓度就显得很必要。相应底物的表观浓度（overall concentration）和水相浓度（waterpool concentration）的Km也有表观Km和水相Km之分，大多数文献报道的是表观Km，其反映的是酶分子、底物、环境间的综合作用。2.固定化酶催化合成多肽研究历史相对较短机遇与挑战并存，与预计今后的研究主要有三个方面：a开发合适的新载体b固定化方法的研究，共价固定化酶研究相对较少，主要使由于酶活损失大，但酶与载体结合牢固，能多次重复使用，选用合适的偶联试剂与载体，可使器有较高的固定化效率与活性，在工业上前景广阔c筛选新菌种、挑选新酶源，扩展肽合成反应的范围。五附表酶法合成短

40、肽实例的归纳（固定(gdng)方法、文献来源、目的短肽名称、产率等）表 格1：氨基酸缩写(suxi)对照表非 极 性 / 疏水氨基酸极 性 / 亲 水 氨 基 酸酸 性碱 性不 解 离AlaValLeuAspLysGlySerThrIleProPheGluArgCysTyrTrpMetHisAsnGln表 格2：短肽合成(hchng)实例编号肽缩写（转化率）酶（载体）溶剂体系反应条件及其它特点来源1工业合成短肽待查1/12Lys-Leu（72）阳离子交换树脂底物溶解度153一些二肽无花果蛋白酶乙醇底物溶解度164一些二肽（90）纯水底物溶解度195Phe-Leu（87）嗜热菌蛋白酶无86Tyr

41、-X胰凝乳蛋白酶乙腈水含量107肽脂肪酶2/68肽蛋白酶809未知木瓜蛋白酶水含量3/2610青霉素G前体脂肪酶511甜蜜素双肽蛋白酶112X-Ala-Phe-Leu糜蛋白酶己烷1913Ag？-Phe多种蛋白酶乙腈，乙酸乙酯8/614Phe-Arg/Gly胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶乙腈温度影响1015Phe-Phe胃蛋白酶正辛烷水相pH影响1116Gly-Trp-Met胰凝乳蛋白酶乙腈添加三乙胺1217未知枯草杆菌蛋白酶3-戊酮添加缓冲盐对13188肽丝氨酸、巯基蛋白酶氨基酸酯省去了去保护的步骤1519Phe-Val木瓜蛋白酶乙酸乙酯四种载体1620X-Gly木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶甲醇、二

42、氯甲烷1721Asp-Phe/Ala嗜热杆菌蛋白酶三级戊醇1822Tyr-Gly-Gly、Phe-Leu胰凝乳蛋白酶、嗜热杆菌蛋白酶二氯甲烷、三级戊醇1923Tyr-Gly胰凝乳蛋白酶二氯甲烷水含量9/8、924Ala-Phe-Leu95胰凝乳蛋白酶正己烷加水合盐缓冲，剧烈搅拌1325未知枯草杆菌蛋白酶多种底物极性1526Phe-Leu胰凝乳蛋白酶乙腈、乙酸乙酯底物保护基1627含Tyr胰凝乳蛋白酶微水乙醇加酶量影响1728未知酶对溶剂的选择性1829未知脂肪酶11/25、2630二肽蛋白酶12/2331小肽胰凝乳蛋白酶（硅藻土）各种LogP例外情况17/1232Gly-Ala脂肪酶（酯酶）醋酸乙酯21/1233Ser-Leu胰凝乳蛋白酶醋酸乙酯1734Asp-Phe嗜热杆菌蛋白酶醋酸乙酯22、2335X-Gly木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶22/236Phe-Ala-Ala胰凝乳蛋白酶（壳聚糖）低温加入聚醇、糖23/11、12、1337Asp-Phe产率低嗜热杆菌蛋白酶（葡聚糖）葡聚糖、PEG、水1438Ala-Tyr蛋白酶有机溶剂浓度1539Tyr-Arg胰凝乳蛋白酶（硅藻土）五种溶剂1640His/Tyr/Phe-Leu胰凝乳蛋白酶（硅藻土）乙基丙烯酸水活度影响1041未知乙腈、二甲基甲酰胺混合有机溶剂1842Tyr-Arg胰凝乳蛋白酶（硅