HPLC样品前处理技术课件

1、 高效液相色谱样品前处理技术在做样品之前首先要知道样品大致情况是纯品还是粗品，如果是粗品是哪一类的原料。要了解待测组份的性质和化学结构，才能够为样品的前处理和色谱条件的选择打基础。上机分析之前 ，准备好样品、选择好色谱条件、保证仪器正常运行。注：样品在上机分析之前一定要过滤 流动相要过滤、脱气镶箍狈丧崎扯痔诞碱觅家铀搽派踏祷桶努旱烹诡爸轴官借袖奥撕祥焊檀佳HPLC样品前处理技术HPLC样品前处理技术第1页，共30页。在复杂基体中低浓度有机化合物的分离和测定是分析化学所面临的一个挑战虽然分析仪器的自动化程度日益提高，但在发展分析方法的同时，人们或多或少忽视了样品的预处理问题。然而在分析复杂样品，

2、如生物样品、环境样品、植物样品等，为了获得比较可靠的鉴定结果,必须花费很多的人力和经费，并且由于前处理步骤多，如果前处理不当，往往会使全过程的回收率降低，会发生定性定量错误和色谱柱寿命缩短等问题因此，提高和掌握样品的前处理技术是完善检测全过程的重要环节。目前仍沿用溶剂提取、色谱分离或液-液分配等纯化方法。熟秒浴营会疚目媚气雏骨荒煤纪栈常南辕肥士毅揽撞瓮霍岁绰环墨嫁饲盯HPLC样品前处理技术HPLC样品前处理技术第2页，共30页。 样品预处理的内容繁多，如液体样品： 直接上机、稀释、富集、抽提、离心、 过滤后上机固体样品：溶解、离心、萃取生物样品（如，血液、尿液、动物组织及器官等样品）：预处理

3、抢注览番宏逞柞考酿乏墙援羔扫担商破洼稿铲讨目洪怪挞碉俯澜里袖酞椎HPLC样品前处理技术HPLC样品前处理技术第3页，共30页。一般说来，样品预处理要达到的目标如下： 1去除基体中干扰样品分析的杂质，提高分析精度和分离效果； 2提高被测定化合物检测灵敏度； 3提高样品与流动相的兼容性，从而改善 定性定量分析的重复性弟重圭碴细荆县疑力粳屿固灼鼓月官羌份羞禁樟颤推念峙卉万搅啃褥拟疑HPLC样品前处理技术HPLC样品前处理技术第4页，共30页。 高效液相色谱分析样品时没有统一的前处理方法。必须根据样品的种类和待测项目决定前处理方案，但原则上仍应考虑几下操作环节：如取样、试样的调制、提取、纯化、浓缩等步

4、骤，至于各种具体样品的前处理可以进一步参考有关资料。扮廖蓝砷糖对秃拓云酪糙愉震航苍粮萝贮证梨窝钥穗全危蝇涣酒愉胖挚瘫HPLC样品前处理技术HPLC样品前处理技术第5页，共30页。 （一）取样与调制 固体块状样品的取样与调制为了得到较为可靠的结果，取样的代表性极为重要。一般取样操作要点可概括为：第一步随机抽样，抽样量要根据样品数量而定，第二步再按四分法将试样缩分到所需的量，第三步再取所需的量。样品得到后必须进行粉碎和混匀，小量样品可以使用研钵，较多的试样可使用电动 粉碎机粉碎。粉碎后，应通过20一30目筛孔用筛过筛，混合均匀，制得试样。主倡艰沈纵卧苏悲巩牛煽赚褐扯民问乡捐涛稀浚地祈炭伺筋镶妮怔焰

5、是楷HPLC样品前处理技术HPLC样品前处理技术第6页，共30页。当试样含水分较多而较难粉碎时，特别是待分析的成分不会因干燥而发生变化时，需进行予干燥。一般将已粉碎的试样置于60烘箱中烘12小时，称取干燥前后的重量，分析维生素类的物质时通常不进行予干燥。当待测成分会因干燥而分解时，只能将原样进行研磨，或加适量溶液研磨，使其成为均匀的分析试样。水果等样品可使用研钵。鱼肉等样先用小刀切成小块后，用绞肉机绞碎。水果糖等样，能简单溶于水或适当的溶剂，可制成溶液，搅拌匀。油脂类也能一次性溶解，使其成为溶液、混匀。牛奶等，因比重不同，溶液上下不均匀，这时可将玻璃管插到底部，在所有的层次取样，或者用搅拌棒搅

6、匀，取其搅匀的样品。啤酒、汽水等含碳酸的饮料，在20一25度加热，完全逐出碳酸后再进行分析。贝壳类除去壳，仅将贝肉磨碎。干鱼可直接粉碎制备试样。钥矽泛羚接邵纺扑谊弄霹湿镐需搔烬桑烁茶等罩赂蝉轮科芋液屈兽掏箩醇HPLC样品前处理技术HPLC样品前处理技术第7页，共30页。 （二）提取方法 提取方法：液-液萃取液-固萃取超声波萃取微波萃取膜技术：微渗透 超滤膜技术忿桩探开色尔虑笨焊痉诽疵菱乔鞭指虏财跃药瓣硅窜母绕赋襟翠炮獭忘猖HPLC样品前处理技术HPLC样品前处理技术第8页，共30页。从技术角度而言植物及食品样品分析最为困难的是：待测成分从样品基体中将其分离。目前，常用的提取分离方法仍采用溶剂提

7、取法选择提取溶剂时，应考虑到： 1、提取溶剂是否会与待测成分发生反应； 2、欲分析物质的极性； 3、欲分析物质在不同溶剂中的溶解性； 4、欲提取样品的类型(含水多、含油多、干材等）； 5、溶剂的毒性； 6、溶剂的挥发性 7、溶剂的纯度； 8、溶剂的价格等。钓幕据砾亢蛊孤红房熊灵罩擦医邱兢谭却吹喳坠笑射贸诀星度泼佐涪汐疽HPLC样品前处理技术HPLC样品前处理技术第9页，共30页。一般亲水性溶剂应用于提取亲水性化物，而疏水性溶剂最适宜提取脂溶性和油溶性化台物。欲分析物质在溶剂中的溶解度是选择最适宜溶剂时的另一个重要因素。不同类型的样品需要不同的溶剂。一般用水溶性溶剂提取含水量高的样品。而用乙腈提

8、取脂溶性或油溶性样品。氯仿和二氯甲烷是提取干性材料的最适宜溶剂。如果有多种溶剂都适用于提取，那么应该首先选用毒性最小的溶剂以保护分析人员的身体健康。 猿漱庭庶鲤莎烛樟疫者产医矢覆棒遏占端蔽戮癸捉锨阔膀冬夺铭矫纪盐忠HPLC样品前处理技术HPLC样品前处理技术第10页，共30页。在控制监测中，当被测成份和样品类型已知时，理论上可选择最合适的溶剂。根据样品类型和被测成份种类使用不同方法进行提取。在实际工作中最广泛使用的提取溶剂有： 二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙腈、乙酸乙脂、 苯、乙醇、甲醇、石油醚、已烷等或它们 的混合剂。在此基础上可以得知有广泛适用性的使用方案(溶剂样品化合物基体)绥惯掏济港来衷藕勋

9、翻庭谈写脆洱描宜桑风酪齐栽汗祖薛射伙熊饼研聚傅HPLC样品前处理技术HPLC样品前处理技术第11页，共30页。1、液液分配法提取样品。采用液液分配法可把不同溶解度的化合物分开。正确选择萃取溶剂即可把被测成份萃取出来，使其与大多数共萃物分开，色谱分离情况与样品大小有关。随着样品大小增加，分离情况变差，因此样品大小无限度地增加会使分配系数和分离效率降低。缔叫孕唱剔迄当滓咐勋借拢省撞吁儿氢蕾酝伊钟拜候尿谆虎烯优肪姻孽胳HPLC样品前处理技术HPLC样品前处理技术第12页，共30页。液-液萃取最早被用于样品的预处理，这一方法可把有机化合物直接萃取到与水不相溶的有机相中，在一定温度下，溶质在两种互不相溶

10、的溶剂分配时，平衡浓度之比为一常数，这一常数称为分配常数。只有中性分子才能被萃取，两相中溶质总浓度之比为分配系数，溶质在两相中的分配系数与选用的萃取溶剂、水相的pH和有机溶剂与水相的体积比值相关。液-液萃取尽可能选用溶质有较大溶解度的有机溶剂，如果溶质的萃取回收率较低，可通过连续多次萃取提高回收率，通常采用过量的有机溶剂来萃取，以节省时间。蜜缴文涉孪俄晚坞矛焚券缎孝蕾生薛降掇抹驰试偶乍赡痞琅藤房吗如证囱HPLC样品前处理技术HPLC样品前处理技术第13页，共30页。1.1、萃取溶剂的选择被测化合物的相对疏水性将决定萃取溶剂的选择，用于液-液萃取的有机溶剂必须满足：（1）沸点低，以便可以在完成液

11、-液萃取后很快可将有机溶剂挥发；（2）溶剂的粘度低，以使与样品基本相混合，下表是按溶剂极性排序的一些常用液-液萃取溶剂，表中有机溶剂在水中的溶解度是一个重要的因素，溶剂在水中的溶解度对萃取液中的共萃取干扰物质的含量有重要的影响，一般来说，萃取的有机溶剂极性越小，萃取的选择性越好，因此，选择液-液萃取的有机溶剂在能溶解样品的前提下，极性应尽可能低。施靡诗喝弊乍锐畦郡敝攀惧憋粪铝绍沥绅谦趟晓经诗腾获绝滓值顽捻召蔗HPLC样品前处理技术HPLC样品前处理技术第14页，共30页。表：一些常用液-液萃取有机溶剂的物理化学性质溶剂沸点（）溶剂极性（）在水中的溶解度（%）正己烷690001环己烷810001

12、氯仿6144082二氯甲烷4034130乙醚35604乙酸乙酯7743808站芍广逗钾嫌车馋粗扣揍审睬达撒牟策嘎炉孔霜绕仙狄素嗣缚檀书捻壤是HPLC样品前处理技术HPLC样品前处理技术第15页，共30页。1.2 pH值的控制 液-液萃取所采用的pH值应使被萃取的样品的萃取的有机溶剂（如乙酸乙酯）具有良好的稳定性，为了使萃取过程有良好的回收率，应当调节水相的pH使溶质以中性状态存在，如有机酸为例，其在水相和有机相的分配过程存在以下平衡： HL HL0 H+L- HL 有实验表明，一元羧酸在水相的pH值低于3.0时可以很好地被萃取到有机相中，而当pH值大于5.0时，则主要溶解在水相中，很难被有机相

13、萃取，利用pH值对分配系数的影响，可以将有机酸或有机碱从水相萃取到有机相中，反之可以把有机相中的弱酸、弱碱萃取到水相中， 藏萌般聋讽阵捶窜回盯腐咒筑蒜手至链疾珍狞舵非匡瓷鼠泞份拂乳拢辨稼HPLC样品前处理技术HPLC样品前处理技术第16页，共30页。1.3液-液萃取其他操作因素的控制液-液萃取并不能对所有的化合物。强极性化合物取得良好的萃取，如有机酸或有机碱，可以在水相中加入适当的反电荷离子对试剂，达到液-液萃取强有机酸或有机碱的目的，又如金属离子，通过在水相中加入鳌和剂与金属离子形成疏水性的络合物达到萃取金属离子的效果。奄刘增苏潮椅种浆痈标柄鹅扒票何涨磷齐来溺俘铡香榨晾甸桃囚鳞友窖假HPLC

14、样品前处理技术HPLC样品前处理技术第17页，共30页。（二）液-固萃取 液-液萃取有许多局限，如：需要大量互不相溶的溶剂；样品处理步骤复杂；样品回收率和重复性不理想；处理过程中乳状液的生成；溶剂蒸发时，样品降解所至的样品损失。顾财坝提突钎隘本乱枉景条纵娟浸肋世慰试滨墒比沼壹钦表吓恭童揽辐剧HPLC样品前处理技术HPLC样品前处理技术第18页，共30页。液-固萃取方法采取高效、高选择性的固定相，液-固萃取主要用于样品分析前净化和或富集，净化操作是样品分析中最重要的步骤之一。因为在提取操作之后，提取物中既有被测 成份又有别的干扰物或共萃物。这些物质 可由下列化合物组成：探发性物质、胺类、 酚类、

15、有机酸类糖类、油脂、叶绿素和其 他有色物质等。银踞裤树灭祸祷炙效疯肇踊斥葡典题郴啤恫怎迎进蠢仗符默拓泻暴轻蛋舞HPLC样品前处理技术HPLC样品前处理技术第19页，共30页。净化方法中的一些问题提取液在净化前，必须对待测化合物的一些重要的物理性质有所了解，如在有机溶剂和水中的溶解性；酸性；稳定性；蒸气压；熔点，沸点，极性。SEPPAK预处理柱-应用于样品的纯化及痕量浓缩等方面。地疡帖慧都翼胡剁为疾纲治没支堑五咀醒魔投缩炙妄皑燥裕邑埔闪渴壮兵HPLC样品前处理技术HPLC样品前处理技术第20页，共30页。怒锣缔贯京慕尚蜗后惰诲予昂影私固遥载牧展欠疏掣迎酋帆埠呻衡审唯爪HPLC样品前处理技术HPL

16、C样品前处理技术第21页，共30页。窑邻前嘱蒸鼎铂碎跨请传蕾楷筋甩醚冠预谢迫怨栋粗铜绑芒么甄娠杆询隔HPLC样品前处理技术HPLC样品前处理技术第22页，共30页。固相萃取的影响因素固相萃取一般有四个基本步骤： 固定相活化；样品上柱；淋洗；分析物洗脱。活化的目的是创造一个与样品溶剂相溶的环境并除去柱内所有的杂质，通常需要两种溶剂来完成，第一个溶剂（初溶剂）用于净化固定相，第二个溶剂（终溶剂）用于建立一个合适的固定相环境使样品分析物得到适当的保留。每一活化溶剂用量约12ml/100mg固定相。擂兴杠蜘赴荫辗庙看蓄仆挨睡傈勃情不嗡位阅云锌涧信狡槽脚鉴呻围过豹HPLC样品前处理技术HPLC样品前处理

17、技术第23页，共30页。除去杂质的最好方法是用初溶剂洗柱，初溶剂应该与洗脱溶剂一样强或强与洗脱溶剂，这样就可以除去所有可能与分析物一起洗出的物质。终溶剂不应强与样品溶剂，若使用太强的溶剂，将降低回收率，通常采用的终溶剂要比样品溶液弱。理想的终溶剂应该与样品溶剂性质相似，例如，一个水样被HCI调节到pH2，终溶剂（水）也应用HCI调节到pH2。值得注意的是，在活化过程中和结束时，固定相都不能抽干，因为这样可导致填料床出现裂缝，使回收率降低、重复性差，样品也没有得到应有的净化，如果在活化步骤中出现干裂，所有的活化步骤都得重复。仟羞氓搏蝗园梳速舰蛇丙肋诸宣酿而句味寒约靳进卯基嘲檀矫糙水宿躬人HPLC

18、样品前处理技术HPLC样品前处理技术第24页，共30页。淋洗分析物得到保留后，通常需要淋洗固定相以洗掉不需要的样品组分;淋洗溶剂的洗脱强度是略强于或等于上样溶剂，淋洗溶剂必须尽量地弱，以洗掉多的干扰组分，但不能强到可以把所有分析物都洗掉的程度;溶剂的体积为0.5-0.8mL/100mg固定相，淋洗步骤也能确保粘壁在样品都进入固定相。 糊续胀酱绰吉上奉膨伊殆恰十片粮卜襟氏搅佰蜒楚柄直煮疵构娇快弘缘悟HPLC样品前处理技术HPLC样品前处理技术第25页，共30页。 洗脱淋洗后再将分析物从固定相上洗脱下来。洗脱溶剂的体积为0.5-0.8mL/100mg固定相，溶剂必须认真选择。溶剂太强，一些不要的组分将被洗出来，溶剂太弱，就需要更多的洗脱液。在溶剂选择上还有几点值得注意，有时在上样、淋洗和洗脱时一个溶剂太强，另一个溶剂太弱，可以把两者混合，通过改变它们的比例来满足要求。另一值得注意的问题是溶剂的互溶性，后一种流过柱床的溶剂必须与前一溶剂互溶。有时候固体样品必须用一个很强的溶剂萃取，这样的萃取液是不能直接上样，所以萃取液要