真菌诊断进展

1、深部真菌感染的非培养(piyng)诊断进展北京大学第一医院北京大学真菌和真菌病研究(ynji)中心余 进共六十一页AIDS插管等侵袭性治疗肿瘤和免疫抑制治疗骨髓和实体器官移植广谱抗生素治疗 侵袭(qnx)性真菌感染率上升共六十一页+600%+300%+300%Martin et al, NEJM 2003;348:1546深部真菌感染(gnrn)不断增加共六十一页国内深部真菌(zhnjn)感染不容忽视刘正印等，中华(Zhnghu)医学杂志2003年3月第83卷第5期共六十一页国内情况(qngkung)我院血液科(2004.5-2005.5共118例患者(hunzh)确诊和临床诊断有7例,发生率

2、为5.9%以血液病为主的深部真菌感染高危患者中，发生感染的危险因素有2种及2种以上广谱抗生素应用、念珠菌菌落定植和应用尿管，其中广谱抗生素应用是最主要的危险因素 共六十一页深部真菌(zhnjn)感染条件致病性真菌念珠菌病曲霉病隐球菌(qijn)病其他共六十一页对于(duy)侵袭性真菌感染诊断滞后(zh hu)治疗手段有限基础疾病病死率很高念珠菌血症若不治疗死亡率可以达到45-76%侵袭性曲霉病死亡率高达55-70%共六十一页诊断(zhndun)方法显微镜检查(jinch)培养血清学分子生物学共六十一页镜检和培养(piyng)方法敏感性低 血培养：在肿瘤和血液病病人中，50%尸检证实深部念珠菌感

3、染的病例血培养阴性。培养结果阳性仅表示存在某种真菌，区分定植和感染困难培养时间(shjin)长有些标本采集困难共六十一页非培养(piyng)方法优点快速报告(bogo)结果敏感性提高取材简便多以真菌在致病状态产生的物质为检测标志物，结果阳性提示有致病性定量检测可判断感染严重程度及疗效评估共六十一页非培养诊断(zhndun)的方法简介真菌细胞壁成分（1-3） - - D-葡聚糖检测（G试验(shyn)） 真菌抗原检查半乳甘露聚糖（galactomannan) 抗原（GM试验) 甘露聚糖(mannan)抗原隐球菌荚膜多糖抗原（乳胶凝集试验）真菌特异的代谢产物D-阿拉伯糖醇真菌 DNA 的检测共六十

4、一页深部真菌(zhnjn)感染的诊断标准EORTC/MSG2008修订版宿主(szh)因素临床特征病原学真菌镜检真菌培养组织病理学检查血清学检查方法（间接证据）CSF隐球菌抗原阳性确诊GM-test, G-test临床诊断Clinical Infectious Diseases 2008; 46共六十一页（1-3） - - D-葡聚糖检测(jin c)共六十一页（1-3） - - D-葡聚糖检测(jin c)b1,6glucansb1,3PPL bilayerchitinergosterolb1,3 glucansynthasemannoproteins真菌细胞壁成份，占50%以上其他微生物、

5、动物(dngw)及人的细胞不含该成份用于侵袭性真菌感染的早期诊断共六十一页 方法(fngf)：G试验-葡聚糖可特异性激活鲎（Limulus）变形细胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故称G试验。Beta-D-glucan 通过激活G因子（ Factor G）引起凝集内毒素通过激活C因子（Factor C）引起凝集试剂盒: 祛除(qch)Factor C Glucan 特异共六十一页BG检测(jin c)的特点 可检测多种致病真菌感染念珠菌,曲霉,肺孢子菌,镰刀(lindo)菌,地霉,组织胞浆菌,毛孢子菌等不能用于检测隐球菌和接合菌感染阳性结果代表存在侵袭性真菌感染真菌对数生长期释放量最大 ,可

6、被体内葡聚糖酶降解(glucanase)每周检测2次共六十一页BG检测(jin c)用于念珠菌血症 敏感度为62%-100%，特异度为64%-88%不同种念珠菌感染对葡聚糖检测无明显影响白念珠菌,光滑(gung hu)念珠菌, 热带念珠菌,克柔念珠菌,季也蒙念珠菌和葡萄牙念珠菌近平滑念珠菌BG水平较低Clin.Infect. Dis. 2005.41:654659.J. Clin. Microbiol. 2005.43:59575962J. Clin. Microbiol. 2008.46:10091013共六十一页BG检测(jin c)用于念珠菌血症 BG检测敏感度明显(mngxin)高于M

7、annan检测79.6%vs42%阳性早于血培养阳性和临床症状出现对于念珠菌血症, BG检测是首选检查Clin.Infect. Dis. 2005.41:654659.J. Clin. Microbiol. 2005.43:59575962J. Clin. Microbiol. 2008.46:10091013共六十一页-（1-3）-D-葡聚糖(BG)检测(jin c)用于侵袭性曲霉感染（IPA)敏感度为55%-100%特异度为52%-100%对于(duy)确诊IPA，阳性率为85.7-100%高度可疑IPA，阳性率为52.4-66%Med. Mycol. 2006.44:51635172J.

8、 Clin. Microbiol. 2008.46:10091013J. Clin. Microbiol. 2005.43:299305共六十一页BG检测( 阳性界值为60pg/mL)和GM（阳性界值为1.0）比较(bjio)二者在体内的代谢动力学相似，敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值均相同，分别为87.5%、89.6%、70%和96.3%二者联合可以提高特异度和阳性预测值，对敏感度和阴性预测值没有影响J Clin Microbiol, 2005, 43:299-305. 侵袭性曲霉感染（IPA) BG检测(jin c)与半乳甘露聚糖(GM)检测共六十一页BG检测(jin c)与半乳甘露

9、聚糖(GM)检测BG检测与GM检测敏感度67%vs38%特异度90%vs100%感染曲霉(qmi)种类的影响抗真菌药物应用的影响抗生素应用的影响共六十一页BG检测(jin c)对于(duy)烟曲霉和非烟曲霉感染无差别OrganismSensitivity,%Specificity,%PPV*,%NPV*,%A. fumigatus n=69618875 79A. non-fumigatus n=3964886488J. Clin. Microbiol. 2008.published online共六十一页GM检测(jin c)烟曲霉(qmi)感染的敏感性明显低于非烟曲霉(qmi)感染Organ

10、ismSensitivity,%Specificity,%PPV*,%NPV*,%A. fumigatus n=6913999066A. non-fumigatus n=3949999586J. Clin. Microbiol. 2008.published online共六十一页抗真菌治疗对GM检测(jin c)的影响抗真菌治疗(zhlio)使GM检测敏感性下降确诊IPA的造血干细胞移植未接受抗真菌治疗，GM试验的敏感度为87.5%接受抗真菌治疗，敏感度为20%应用卡泊芬净后，GM值会出现升高BG检测的敏感性与抗真菌治疗无明显关系Clin.Infect. Dis. 2005.40:17621

11、769.Clin.Infect. Dis. 2005.41:654659.共六十一页抗生素治疗对BG检测(jin c)和GM检测的影响BG检测假阳性(yngxng)与应用内酰胺类抗生素无关Antimicrob. Agents Chemother. 2006.50:34503453.GM检测哌拉西林/他唑巴坦导致假阳性共六十一页IPA的诊断(zhndun)方法BG检测(jin c)GM检测烟曲霉可能阳性率低二者联合可以提高检测的阳性率共六十一页BG检测(jin c)用于肺孢子菌检测BG是肺孢子菌包囊壁的组成成分可释放入血液(xuy)可用于肺孢子菌检测共六十一页BG检测(jin c)57名PCP患

12、者238名非PCP患者敏感度92%，特异(ty)度86%阳性预测值0.61，阴性预测值0.96界值31.1pg/mLCHEST 2007;131:1173-1180共六十一页BG检测(jin c)用于PCP诊断敏感度好临床一致性好数值升高明显，甚至(shnzh)高于念珠菌感染PCP( 1,299- 1,151 pg/ml; median, 945 pg/ml)念珠菌血症 ( 700- 779 pg/ml; median, 447 pg/ml).J. Clin. Microbiol. 2008.46:10091013共六十一页（1-3） - - D-葡聚糖(BG)检测(jin c)方法Fungi

13、tec-G (Japan)界值为20pg/mL Fungitell(US)界值为60pg/ mL或80pg/mL GKT-5M Set动态(dngti)真菌检测试剂盒 (国内金山川公司) 界值为20pg/mL 或50pg/mL 共六十一页Fungitec-GTM 20pg/mL41名确诊IA患者中有37名阳性59名无真菌感染的肿瘤或结缔组织病的对照中，无一例(yl)阳性 J Clin Microbiol, 1995, 33:3115-3118 202名发热患者敏感度和特异度分别为90%和100%，阳性预测值为59%，阴性预测值为97% Lancet, 1995,345:17-20.共六十一页F

14、ungitellTM 60pg/mL ，80pg/mL60pg/mL 敏感度70%，特异(ty)度87%80pg/mL敏感度64%，特异度92% Clin Infect Dis, 2005, 41:654-659.共六十一页GKT-5M Set动态真菌(zhnjn)检测试剂盒 对于侵袭(qnx)性念珠菌感染以健康人做对照敏感度88.9%, 特异度90.2%阳性预测值50%, 阴性预测值98.7%界值定为13.7pg/ml中国真菌学杂志，2007，2（4）：202-206共六十一页GKT-5M Set动态真菌(zhnjn)检测试剂盒 北京大学第一医院2008年4月至2008年8月住院患者临床怀疑

15、侵袭性真菌感染(gnrn)的患者98例 50pg/mLBG50pg/mL15例，IFI组7例敏感度63.6%，阳性预测值46.7% BG50pg/mL83例，对照组79例特异度90.8%，阴性预测值为95.2% 共六十一页假阳性(yngxng)问题 污染（无热源的试管、枪头和蒸馏水等）血液透析、腹膜透析纱布或其他医疗(ylio)物品（外科手术）某些品牌的静脉制剂（白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白等）抗肿瘤多糖（香菇多糖）某些细菌败血症患者（尤其是链球菌败血症）假阳性与应用内酰胺类抗生素无关对策: 动态监测葡聚糖的变化共六十一页总结(zngji)BG检测可以早期、快速诊断侵袭性真菌感染，可用于真菌感

16、染早期筛查适用于念珠菌,曲霉,肺孢子菌,镰刀菌,地霉,组织胞浆菌,毛孢子菌等不能用于检测隐球菌和接合菌感染敏感度为64-93%，特异性为90%（国内）与GM试验联合可提高阳性率2次或2次以上阳性可降低假阳性率高危患者(hunzh)建议每周检测1-2次共六十一页半乳甘露(gnl)聚糖抗原检测（GM试验）共六十一页GM抗原检测(jin c)原理曲霉(qmi)galactomannan antigen 大鼠EBA-2单克隆抗体双抗夹心法共六十一页GM试验(shyn)敏感度为0.71，特异度为0.89血液系统恶性病中，其敏感度和特异度分别(fnbi)为0.7和0.92骨髓移植患者中，其敏感度和特异度分

17、别为0.82和0.86实体器官移植患者中，敏感度下降到0.22，特异度为0.84成人敏感度和特异度分别为0.62和0.87儿童敏感度和特异度分别为0.89和0.85 ,文章较少（仅有2篇），但是呈现出较高的敏感度和特异度。共六十一页假阳性(yngxng)哌拉西林/他唑巴坦Gluconate与其它的细菌或真菌成分有交叉(jioch)反应 皮炎芽生菌、黑孢霉、拟青霉、产黄青霉、马尔尼菲青霉、粉红单端孢、头状地霉等肠道中定植的曲霉释放GM进入血液循环 谷类食物中的GM抗原共六十一页曲霉感染检测的影响(yngxing)因素半乳甘露聚糖在血中存在时间短，建议： 高危人群每周至少检测2次 结合影象学、培养

18、结果(ji gu)综合分析诊断结果判定标准界值的确定抗真菌治疗情况共六十一页GM试验(shyn)试剂盒推荐界值为1.5时灵敏度为64.7%, 特异度为93.5%连续(linx)2次1.5为阳性灵敏度为63.6%，特异度为85.7% 临床皮肤科杂志，2005，34（12）：816-817中华内科杂志，2006，42（12）：992-995共六十一页GM试验(shyn)对于46例造血干细胞移植后患者的167份血样进行GM抗原的测定，发现以单次测定大于1.0，或者连续(linx)2次大于0.8为阳性标准，试验的灵敏度和特异度均较高，根据上述界值，该试验的灵敏度为81.8%，特异度为93.3%。 中华

19、医学杂志，2007，28（2）：83-86 共六十一页GM界值FDA将界值定为0.5界值从1.5降到0.5敏感度从76.3%升到97.4%- 21%特异(ty)度从97.5%降到90.5%- 7%连续2次I0.5,阳性预测值更好Clin Infect Dis. 2007 共六十一页抗真菌治疗(zhlio)的影响确诊侵袭性曲霉病的造血干细胞移植未接受抗真菌治疗，GM试验(shyn)的敏感度为87.5%接受抗真菌治疗，敏感度为20%治疗开始后半乳甘露聚糖的测定值会下降，未见下降意味着治疗失败应用卡泊芬净后，半乳甘露聚糖值会出现升高共六十一页GM in BAL不同人群对结果的解释不同血液系统恶性病、

20、造血(zo xu)干细胞移植BAL中GM值的升高能够提高IPA诊断的灵敏度实体器官移植（肺移植除外）特异度为92.9%,PPV为62.5%无免疫抑制的ICU患者敏感度为88%，特异度为87%免疫正常的患者和肺移植患者假阳性高（菌落定植）对于无免疫抑制的患者建议同时检测血液和BAL的GM共六十一页隐球菌乳胶凝集(nngj)试验共六十一页隐球菌(qijn)LA检测荚膜抗原(kngyun)共六十一页隐球菌(qijn)乳胶凝集试验多克隆(k ln)IgG抗体敏感性可达99%共六十一页假阴性前带效应解决(jiju)方法：稀释假阳性(yngxng)与类风湿因子、丝孢酵母菌、DF-1菌感染血清有交叉反应解决

21、方法：采用单抗、标本前处理共六十一页隐球菌(qijn)性脑膜炎涂片墨汁染色法检出隐球菌的阳性率分别为64.86%乳胶凝集(nngj)试验检测患者血清和脑脊液中隐球菌荚膜多糖抗原的阳性率分别为91.67%, 100%第二届全国深部真菌感染学术会议 ，2007.3.15-3.18，杭州 共六十一页分子生物学方法(fngf)共六十一页分子生物学方法(fngf)以PCR和分子杂交技术为基础(jch)巢式PCRPCR-ELISAReal-time PCR反向线点杂交生物芯片共六十一页PCR方法(fngf) 敏感度、特异度差异较大 4%-100%, 7.9%-100%差异原因1 真菌DNA的提取效率2 引物质量3 PCR反应种类（普通PCR，巢式PCR或者实时定 量PCR）4 研究人群的大小，基础疾病5 样本种类（血浆、血清(xuqng)、全血或者支气管肺泡灌 洗液）缺乏标准化方法共六十一页DNA检测(jin c)用于IPA DNA检测结果与半乳甘露聚糖检测和高分辨率CT的结果有良好的一致性 DNA检测阴性