细胞与分子生物学技术综合实验二课件

1、综合实验已经完成PCR反应液配置 2* Master Mix 10 l 模板-即抽提的基因组DNA片段 3 l 引物 ( AL1+AL3) or (AL2+AL3) 2 l H2O 5 l每个样品分2管进行扩增PCR反应条件（DNA扩增仪设定反应条件）预变性： 94 10 min模板DNA的变性： 94 30 sec模板DNA与引物的退火： 58 30 sec引物延伸： 72 30 sec末次循环后延伸： 72 10 min保温： 10 Hold注意：PCR试管做好记号39个循环多聚酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）类似于DNA 的天然复制过程：经过变

2、性、退火、延伸多次循环, DNA 扩增倍数可达2n倍。PCR是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。PCR技术简史 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明PCR 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段Taq DNA聚合酶酶活性(%)温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 2094变性50-65退火72延伸72延伸94变性50-65退火PCR循环22557294时间（min）温度（）PCR的基本原

3、理适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72引物1引物2DNA引物Taq酶Taq酶PC

4、R的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95第1轮结束第2轮开始PCR的特点 灵敏度高 简便、快速 对标本的纯度要求低，血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA 引物设计 引物长度以15-40 bp为宜 碱基尽可能随机分布，G+C占50-60% 引物内部避免形成二级结构 两引物间避免有互补序列PCR的反应体系Taq DNA聚合酶 2.5 U4种dNTP混合物 各200 mol/L引物 各10100 pmol模板DNA 0.12 gMg2+ 1.5 mmol/L 模板浓度一般为100 ng/100 L，浓度过高会导致反应的非特异性增加 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合

5、酶抑制剂、DNA结合蛋白。 PCR反应条件 引物浓度0.1-0.5 mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降 Taq DNA聚合酶0.5-2.5 U/50 l，酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量 四种dNTP浓度应相等 Mg2+ 是DNA聚合酶的激活剂，0.5 2.5mmol/L基于PCR的扩增产物长度多态性（PCR-APLP）根据已知DNA片段两端序列设计引物，一端是等位基因特异性引物，另一端是共同引物；对已知基因 DNA 片段再进行PCR特异扩增；特异的引物配对可以扩增出某一特异基因型的片段，根据扩增出来的DNA条带大小的差异，可以分析基因型（纯合型、杂合型）A

6、LDH2引物AL1 5-TAG GAC ACT CAC AGT TTT CACAT C-3 (78bp)AL2 5-CTC TCA CAG TTT TCA CTT T-3 (73bp)AL3 5-AAG ATG TCG GGG AGT GG-3每个样品EP管1 EP管2结论引物AL1+AL3AL2+AL3条带出现78 bp不出现73 bp野生型纯合子基因条带不出现78 bp出现73 bp突变型纯合子基因条带出现78 bp出现73 bp野生型和突变型杂合子基因综合实验琼脂糖凝胶电泳Agarose gel electrophoresis实验原理-琼脂糖凝胶电泳技术 琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖

7、。其结构单元是D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。其本身不带有电荷。因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。核酸凝胶电泳的基本原理 核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移。 因此，同一凝胶中、一定电场强度下在凝胶上可分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核酸分子。DNA的迁移速率决定因素DNA分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比。琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快。 DNA的构

8、象 一般同一分子：超螺旋环状线状松弛环状凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比Agarose gel electrophoresis 不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围浓度（%）标准 (kb)高强度(kb)低熔点(kb)低黏度低熔点(kb)0.31-500.50.7-250.80.5-150.8-100.8-101.00.25-120.4-80.4-81.20.15-60.3-70.3-71.50.08-40.2-40.2-42.00.1-30.1-33.00.05-10.5-14.00

9、.1-0.56.00.01-0.1电泳缓冲液 TAE、TPE及TBE都是常用电泳缓冲液。三者相比：1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%；4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。 凝胶上样缓冲液上样缓冲液： 上样在加样之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液。上样缓冲液的作用： 1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内； 2）使样

10、品带有颜色便于简化上样过程； 3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率 向阳极迁移。琼脂糖凝胶中DNA的检测 通过染色, 紫外灯下检测。 主要有溴化乙锭（ethidium bromide, EB）染色法和SYBR Green染色法。EB被认为是一种强致癌物质sybr-green- 不稳定，易降解GelRed & GelGreen的凝胶染色 它们是一种新型极敏感染料的商品名称。其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号。凝胶中DNA的成像 可以用透射或入射紫外光对GelRed染色的凝胶成像，图像可以直接输出到计算机观察。凝胶的制备及电泳制胶1. 准备好凝胶成型器，插入成型梳。2

11、. 将3 g琼脂糖加至100 ml 1TAE缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全熔化，冷却至60以下。3. 加入10 l GelRed（1: 10000比例）至熔化的琼脂糖液中混匀，但避免出现气泡。 4. 将冷却的琼脂糖倒入凝胶成型器，制备凝胶。电泳1. 待胶变硬，直到它呈乳白状且不透明（约20分钟），小心垂直向上拔出梳子，将凝胶置入电泳槽中，加1TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。2. 用移液器吸取2 l 的6X载样缓冲液于封口膜上，再加入5 l样品，混匀后，小心加入点样孔。 3. 接通电源，调节电压至4-5V/cm，DNA从负极移到正极。电泳时间3060分钟。4. 电泳结束，关掉电源。将电泳完毕的琼脂糖凝胶置于自动成像系统的平台中间;开通紫外光，可见到发出荧光的DNA条带，在电脑中观察图像；关上紫外光电源，在电脑