荷斯坦奶牛隐性遗传疾病检测技术的建立及应用

1、荷斯坦奶牛隐性遗传疾病检测技术的建立及应用报告人：张滢寅作者： 王成导师：张淑君教授华中农业大学13背景2材料和方法结果4讨论一、背景隐形遗传疾病： 有害基因传代 繁殖、生长及经济性状缺陷 人工授精、胚胎移植等现代繁殖技术 扩大危害范围 国内检测技术缺乏，国外费用昂贵 很有必要建立一种准确、快速而且成本较低的遗传疾病鉴定方法 对奶牛群进行检测 淘汰有害基因为健康的选育提供依据疾病DUMPSBLADCVM致病基因UMPSCD18(亚基) 基因SLC35A3碱基突变C405-T405A383-G383Exon4:G-T氨基酸转换精氨酸-终止密码天门冬氨酸-甘氨酸缬氨酸-苯丙氨酸功能缺失不能催化乳清

2、酸转为尿甘酸整合素表达明显减少或缺乏核苷酸糖转运酶不足酶切位点Ava酶切位点消失Taq酶切位点消失无致病分子机理：二、材料和方法材料 132份精液样本； 417头荷斯坦牛的血液样本方法 提取DNA引物设计 退火温度摸索对所有样本进行疾病检测筛选出有害基因携带者AS-PCRCRS-PCRPCR-RFLP测序验证结果返回Allele-specific PCR 根据单碱基突变位点的碱基替代情况设计 PCR 引物， 其中一条引物根据突变位点邻近序列设计， 人为引入错配碱基， 使得引物3端和单碱基突变的一种突变型在 PCR扩增后形成一个酶切位点， 其PCR 产物可用类似 PCR-RFLP方法进行分析。返

3、回Created Restriction Site PCR三、结果AS-PCRCRS-PCRRFLP测序扩大样本检测及应用建立应用验证验证1、DUMPS（尿苷酸合酶缺乏症） 扩增条件：两引物分开扩 Tm：63.31-4：健康个体（90bp）； 5：携带者（261bp/90bp）； M：Marker 1.1 AS-PCR：1.2 利用RFLP和测序技术验证：PCR扩增结果：目的片段为358bp CC：健康个体； CT ：DUMPS携带者； M：MarkerIDUMPS携带者测序结果 健康个体测序结果 所建技术准确、可靠1.3 扩大样本检测549个：（417个奶牛样本和132个精液样本）基因型Ge

4、notype样本数Number基因型频率Genotype frequency等位基因频率Allele frequencyTCCT1000180.00090.9991CC5480.9982合计5491.02、BLAD（白细胞黏附缺陷病）扩增条件：两引物分开扩 Tm：651-2健康个体818bp；3：携带者为818bp/500bp；M：Marker 2.1 AS-PCR：2.2 利用RFLP技术验证： PCR扩增结果：目的片段为961bp 酶切结果：AA：健康个体；M：MarkerI2.3 扩大样本检测：549个（417个奶牛样本和132个精液样本）无BLAD有害基因PCR扩增结果：目的片段为22

5、5bp AA：健康个体；AB：CVM携带者；M：MarkerI3、CVM（脊椎畸形综合症）3.1 CRS-PCR:CVM携带者测序结果 健康个体测序结果 3.2 利用测序技术验证： 该方法准确、可靠基因型Genotype样本数Number基因型频率Genotype frequency等位基因频率Allele frequencyTGGT100.0290.0150.985GG3320.971合计（Total）3421.03.3 扩大样本检测：549个（417个奶牛样本和132个精液样本）单管AS-PCR技术四、讨论准确、快速、大规模应用两步AS-PCR技术PCR-RFLP技术减少了引物设计和条件摸索的难度，更稳定比较比较难度减低快速低成本三种隐形遗传疾病在公牛群携带情况表DUMPS美国198419902%0.2%-2.5%BLAD美国1992199914.1%9.6%波兰1995-19971998-19992000-20012002-20032004-20067.9%4.0%2.1%1.8%0.8%德国199720079.4%0.3%CVM德国200220078.3%2.3% 表