遗基础与基因工程课件

1、遗传基础与基因工程 一、遗传及其分子基础1) DNA作为主要遗传物质的证据2) 核酸的化学结构与DNA复制3) 基因的概念与发展4) 遗传信息的表达与调控二、基因工程及其应用1) 基因工程概述2) 基因工程的基本操作3) 基因工程的基本工具4) 基因工程的应用本章主要内容11、DNA作为主要遗传物质的证据1.1 DNA是遗传物质的间接证据1.2 DNA是遗传物质的直接证据 A) 肺炎双球菌转化试验 B) 噬菌体侵染试验 C) 烟草花叶病毒重建试验1.3 非核酸类的遗传物质一、遗传及其分子基础2遗传物质应具备的三种基本功能：1、复制功能：遗传物质必须贮存遗传信息，并能将其复制且一代一代精确地传递

2、下去。 2、表达功能：遗传物质必须控制生物体性状的发育和表达。3、变异功能：遗传物质必须发生变异，以适应外界环境的变化，没有变异就没有进化。DNA作为主要遗传物质的证据31. 每个物种不同组织的细胞不论其大小和功能如何。它们的DNA在含量上是恒定的，而且配子中的DNA含量正好是体细胞的一半。2. DNA在代谢上是比较稳定的。3. DNA是所有生物的染色体所共有。4. 不同波长的紫外线诱发各种生物突变时，其最有效的波长均为2600，这与DNA所吸收的紫外线光谱是一致的。1.1 DNA是遗传物质的间接证据4(1) 肺炎双球菌转化试验 (1928，英国Griffith/Avery)1.2 DNA是遗

3、传物质的直接证据5DNA是遗传物质的直接证据(2)噬菌体侵染试验(1952，美国Hershey和Chase)6DNA是遗传物质的直接证据(3)烟草花叶病毒重建试验(1956，美国Fraenkel-Conrat)7朊蛋白(病毒)：又称蛋白质侵染因子。朊病毒是一类能侵染动物并在宿主细胞内复制的小分子的无免疫性疏水蛋白质。1982年，美国Prusiner发现羊瘙痒病是蛋白质侵染引起的疾病，并称为“Prion”即朊病毒。朊病毒具有蛋白质的特性，又与“真病毒”有明显差异。朊病毒对许多理化因子有强抵抗力，如甲醛、DNA酶、紫外线、射线和超声波。在80不被破坏，但对苯酚、蛋白酶、尿素等敏感，对干扰素不敏感，

4、迄今尚无有效防治方法。致病机制： 1982年普鲁辛纳提出了朊病毒致病的“蛋白质构象致病假说”，以后魏斯曼等人对其逐步完善。朊病毒的复制机理最引起当今科学家兴趣和关注。 1.3 非核酸类的遗传物质8一、DNA的一级结构二、DNA的二级结构三、RNA的分子结构四、DNA的生物合成2、核酸的化学结构与DNA复制9DNA的一级结构指DNA的组成单位核苷酸残基在分子中的线性排列顺序。由4种脱氧核糖核苷酸以3,5-磷酸二酯键连接起来的直线或环形多聚体。通常用碱基符号表示。一级结构书写方法：从5 到3方向：一、 DNA的一级结构10关于碱基的种类、分子式、核苷酸的种类、结构等是生物化学中讨论的内容。在此谈三

5、个关于核酸一级结构的内容： (一)“四核苷酸”假说； (二) 查伽夫定则及其意义； (三) 核苷酸序列及其测定。核酸的一级结构11Levene (1930)提出“四核苷酸”假说，认为：A）核苷酸是核酸的基本组成单位；B）核酸是“磷酸核糖(碱基)磷酸”的核苷多聚体。四核苷酸假说奠定了核酸化学基础。但同时认为： 1）核酸多聚体是由“四核苷酸结构”重复形成； 2）每个四核苷酸结构包含四种碱基各一个； 所以认为在任何DNA中，四种碱基是等量的，DNA是四核苷酸结构的简单重复。这种观念影响了人们对核酸生物学功能的进一步认识。(一) “四核苷酸”假说12Chargaff于1946-1950年根据纸层析、离

6、子交换层析和紫外分光光度试验结果提出查伽夫定则： A）四种碱基的数量不是等量的； B）同一物种DNA碱基组成不变，物种间则有很大不同； C）嘌呤碱基总量与嘧啶碱基的总量(克分子总量)相等(A+G=T+C)，且A=T、G=C。(二) 查伽夫定则及其意义13查伽夫定则表明：核酸并不是四核苷酸结构的简单重复，核酸的碱基序列信息可能具有重要意义。后来的研究表明：碱基序列正是核酸生物学功能的基础，是遗传信息的内在形式。DNA及RNA分子序列分析技术也是最重要的分子遗传学研究技术：Sanger双脱氧链终止法；Maxam-Gillbert化学修饰法；基于化学法的DNA序列自动分析仪已成为常规实验设备。(三)

7、 核苷酸序列及其测定14(一) DNA分子结构的研究在“四核苷酸结构”理论的误导下，人们普遍认为核酸的组成、结构简单，可能不具有重要功能，一度忽略了对核酸的研究。上世纪中期，众多研究表明：核酸是遗传信息的载体，显然，DNA的结构研究是进一步研究其功能和作用方式的基础。也由此激发了科学家从事核酸结构研究的兴趣，当时进行DNA结构研究的科学家很多，最重要有三个研究组：二、DNA的二级结构15主要工作：鲍林(Pauling)等1951年(提出蛋白质-螺旋模型后)开始研究DNA分子结构。根据阿斯伯利(Astbury)等1938年获得的DNA晶体X射线衍射图像(显示DNA分子晶体呈螺旋结构)进行研究。提

8、出DNA分子三链螺旋结构模型：引入多链、螺旋和氢链等概念。评价：虽然他们提出的模型并不正确，但是其研究方向和所采用的方法却为DNA分子结构模型研究确立了方向。1. 鲍林研究小组16主要工作成就：Wilkins和Franklin改进了DNA分子晶体X射线衍射图谱技术；于1951年获得了更为清晰的图像；结果表明：碱基位于螺旋内侧而磷酸基团位于外侧，并测得了DNA螺旋的直径和螺距。2. 威尔金斯、富兰克林研究小组17Waston/Crick(1951-1953)：研究手段非常简单：用纸板等做磷酸、核糖和碱基模型，拼凑DNA分子的三维结构。理论知识深厚、富于创造性；视野广阔、收集信息全面并善于分析利用

9、。3. 沃生、克里克研究小组18主要基于Chargaff、Pauling和Wilkins等三个方研究成果，Waston和Crick于1953年提出了他们的第三个DNA双螺旋结构模型。现在人们公认这是分子遗传学建立的标志。Waston/Crick和Wilkins于1962年获得了诺贝尔生理学及医学奖。沃生、克里克研究小组191. DNA分子双螺旋结构模型要点(1)(二) DNA分子双螺旋结构模型DNA分子是由两条方向相反的平行多聚脱氧核糖核苷酸链构成，它们围绕一个中心轴形成右手双螺旋。直径为2.0nm，每环绕一周升高3.4nm（螺距），两个相邻的碱基对之间的轴向距离为0.34nm，方向相差36度

10、，因此平均每周含有10个碱基对（bp）。201. DNA分子双螺旋结构模型要点(2)(二) DNA分子双螺旋结构模型磷酸-核糖通过3,5-磷酸二酯键相连形成的亲水骨架，位于双螺旋的外侧。疏水性的碱基处于内侧上下相邻的碱基平面互相平行，且与中心轴垂直。核糖平面与中心轴平行。稳定双螺旋结构的因素主要是碱基堆积力。211. DNA分子双螺旋结构模型要点(3)(二) DNA分子双螺旋结构模型DNA分子的两条链通过有规律的嘌呤-嘧啶碱基配对相结合；A=T；G C；双螺旋结构并没有限制碱基排列顺序。221. DNA分子双螺旋结构模型要点(4)(二) DNA分子双螺旋结构模型大沟（major groove）

11、小沟（minor groove）对于DNA与其特异结合蛋白之间的相互识别非常重要。1.2, 0.850.6, 0.7523DNA分子的X射线衍射图谱24碱基配对及氢键形成25RNA的分子结构在化学组成上也是由四种核苷酸组成的多聚体。它与DNA的不同在于以U代替了T，并用核糖代替脱氧核糖。此外还有一个重要的不同点，就是绝大部分RNA以单链形式存在，但可折叠起来形成若干双链区域。在这些区域内，互补的碱基对间可以形成氢键。但有一些以RNA为遗传物质的动物病毒含有双链RNA。三、RNA的分子结构一个RNA的分子结构26绝大多数DNA或RNA的生物合成，均按照Watson-Crick的碱基互补配对原则，

12、以拷贝预先存在的DNA链（模板链）的方式进行。核酸链合成的方向只有一个：53。特异的聚合酶催化合成DNA或RNA。四、DNA的生物合成27一、经典遗传学中基因的概念二、生化遗传和早期分子遗传学 对基因概念的发展三、现代分子遗传学中基因的概念3、基因的概念与发展28经典遗传学认为基因是一个最小的单位，不能分割，既是结构单位，又是功能单位。基因具有下列共性：1)基因具有染色体的重要特征(即基因位于染色体上)，能自我复制，相对稳定，在有丝分裂和减数分裂时，有规律地进行分配；2)基因在染色体上占有一定的位置（即位点），并且是交换的最小单位，即在重组时不能再分割的单位：3)基因是以一个整体进行突变的，故

13、它是一个突变单位；4)基因是一个功能单位，它控制正在发育有机体的某一个或某些性状。一、经典遗传学中基因的概念29分子遗传学的发展揭示了遗传密码的秘密，使基因的概念落实到具体的物质上，即基因在DNA分子上，一个基因相当于DNA分子上的一定区段，它携带有特定的遗传信息。这类遗传信息或被转录为RNA，包括信使RNA、转移RNA、核糖体RNA；或者信使RNA被翻译成多肽链。另一方面，在精细的微生物遗传分析中查明，基因并不是不可分割的最小单位，而是远为复杂得多的遗传和变异的单位。 二、生化遗传和早期分子遗传学对基因概念的发展30随着现代遗传学的发展，在分子水平上，根据重组、突变和功能将基因分成3个单位：

14、 1）突变子：就是指性状突变时产生突变的最小单位。一个突变子可以小到只有一个碱基对； 2）重组子：就是指性状重组时，可交换的最小单位。一个交换子可以只包含一个碱基对； 3）顺反子：表示一个起作用的单位，基本符合通常所述的基因的大小或略小。一段DNA与一个多肽链合成相对应，平均为500-1500个碱基对。 三、现代分子遗传学中基因的概念(一)、现代基因概念31顺反子学说进一步把基因具体化为DNA分子上特定的一段顺序顺反子，基因是一段有功能的DNA序列，是一个遗传功能单位，其内部又是可分的，包含多个突变子和重组子。也就是说，基因包含许多突变子和重组子，可以包含多个功能单位(顺反子)。经典遗传学作为

15、结构单位的基因，实际上包含大量的突变子或重组子，因此其认为基因是最小的结构单位的观念已经不能成立了，然而关于基因是一个功能单位的概念仍然是正确的。现代分子遗传学中基因的概念32根据基因的原初功能可以将基因分为：1. 编码蛋白质的基因，即有翻译产物的基因。如结构蛋白、酶等结构基因和产生调节蛋白的调节基因。2. 没有翻译产物，不产生蛋白质的基因。转录产物RNA不翻译，如编码tRNA、rRNA。3. 不转录的DNA区段。 如启动基因、操纵基因。启动基因是转录时RNA多聚酶与DNA结合的部位。操纵基因是阻遏蛋白、激活蛋白与DNA结合的部位。现代分子遗传学中基因的概念(二)、 基因的功能类型331. 重

16、复基因：指在染色体组上存在多份拷贝的基因。重复基因往往是生命活动中最基本、最重要的功能相关的基因。最典型的重复基因是rRNA、tRNA和组蛋白基因等。2. 重叠基因：同一段DNA序列，由于阅读框架(转录范围)不同，同时成为两个或两个以上基因的组成部分。因此基因在染色体上可能有重叠，甚至一个基因完全存在于另一个基因内部。现代分子遗传学中基因的概念(三)、基因的几种特殊形式343. 断裂基因或隔裂基因：生物遗传和早期分子遗传认为基因是一个连续的、完整的结构，但1977年Doel研究表明，卵清蛋白基因中间存在不表达的碱基序列，表明基因的DNA序列可能是不连续的。外显子：参加蛋白质编码的DNA片段；内

17、含子：不参加蛋白质编码的DNA片段。真核生物基因可能是不同外显子的组合断裂基因。现代分子遗传学中基因的概念354. 跳跃基因：又称为转座子、转座因子、转位因子(transposable element)。生化遗传和早期分子遗传学认为基因在染色体上的相对位置是固定的。后来发现某些DNA序列可以在染色体上转变位置。转座子转位的过程也是一个遗传重组过程；转座子在染色体上的转位可能会引起插入位置基因功能丧失(突变)，再次转位离开插入点时便会发生基因功能的恢复。现代分子遗传学中基因的概念36中心法则：遗传信息从DNADNA的复制，以及遗传信息从DNAmRNA蛋白质的转录和翻译的过程，这就是分子生物学的中

18、心法则(central dogma) 中心法则阐述生物世代、个体以及从遗传物质到性状的遗传信息流向，即遗传信息在遗传物质复制、性状表现过程中的信息流向。最初由Crick提出，并经过了多次修正。4、遗传信息的表达与调控37中心法则阐述的是基因的两个基本属性：复制与表达。关于这两个属性的分子水平的分析，对深入理解遗传及变异的实质具有重要的意义。这一法则被认为是从噬菌体到真核生物的整个生物界共同遵循的规律。近年来的研究发现RNA可以反转录成为DNA，RNA还可以自我复制以及在离体条件下DNA可以直接指导蛋白质的合成，从而增加了原中心法则的信息流向，丰富了中心法则的内容。中心法则及其发展38中心法则及

19、其发展反转录(逆转录)：反转录酶；cDNA。RNA的自我复制。DNA指导蛋白质合成。39基因表达：基因携带的遗传信息转变成可辨别的表型的整个过程。基因表达主要包括转录（transcription）和翻译（translation）两个阶段。转录：以DNA为模板合成RNA的过程。（mRNA、tRNA、rRNA）翻译：是指以新生的mRNA为模板，把核苷酸三联子遗传密码翻译成氨基酸序列、合成蛋白质多肽链的过程，是基因表达的最终目的。遗传信息的转录和翻译40第二部分：基因工程及其应用一、基因工程概述二、基因工程的基本操作三、基因工程的基本工具四、基因工程的应用41基因工程：通过体外重组将外源基因导入受体

20、细胞，使该基因在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作叫做基因工程。基因工程实施的四个必要条件：工具酶，目的基因，载体，受体细胞。基因工程的两个基本特点：1.分子水平的操作；2. 细胞水平的表达。一、基因工程概述421.目的基因的获取2.载体的选择3.目的基因与载体DNA的体外重组4.重组载体引入受体细胞5.重组体的筛选和鉴定二、基因工程的操作技术431. 内切酶法2. 机械力降解3. 化学合成4. 通过构建cDNA文库分离目的基因5. 通过构建基因文库分离目的基因6. PCR制备法1. 目的基因的获取441. 限制性内切酶法(鸟枪法或散弹法)：用酶降解染色体DNA(esp原核生物)，将降解的D

21、NA克隆到载体上，从而得到目的基因。优点：原理简单，操作简便，具有一定的应用范围。缺点：随机性有限，盲目性大，筛选麻烦，应用范围有限(只适用于原核生物)目的基因的获取452、机械降解法：用超声波震荡等机械法使DNA断裂。优点：随机性大缺点：所得基因片段不能直接连接，需加工修饰。3. 通过构建cDNA文库：cDNA文库：某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌克隆子群体中，这样的群体称为cDNA文库。目的基因的获取463、化学合成法a.acodeDNA化学合成4.PCR（polymerase chain reaction）5. 通过构建基

22、因文库基因文库(genomic library)：因限制性内切酶将基因组DNA切成片段，每一段与一个载体连接成重组DNA，并引入宿主细胞进行扩增，得到分子克隆的混合体，称基因文库。目的基因的获取47是一个有自我复制能力的复制子(replicon)；能在受体细胞内大量增殖，即有较高的复制率；载体上有限制性内切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到载体DNA的一定位置上；载体上必须有一种遗传标记，以便及时把极少数“工程菌”或“工程细胞”选择出来。原核受体细胞载体主要有细菌质粒和噬菌体两类。动物细胞载体主要有SV40病毒。植物细胞则主要是Ti质粒。2. 载体的选择481) 粘性末端连接：限制性核酸内

23、切酶处理可使参加重组的两个DNA分子产生“榫头”和“卯眼”似的互补粘性末端。然后低温下“退火”。由于每一种限制性核酸内切酶所切断的双链DNA的粘性末端有相同的核苷酸组分，所以当两者相混时，凡粘性末端上碱基互补的片段，就会因氢键的作用而彼此吸引，重新形成双链。在连接酶的作用下，供体的目的基因就与载体的DNA片段接合，形成一个完整的有复制能力的环状重组载体嵌合体(chimaera)。载体经酶切后，易自身环化，形成自身载体。处理方法之一：碱性磷酸酶处理5-P。3. 目的基因与载体DNA的体外重组49目的基因与载体DNA的体外重组2) 利用人工接头(linker)连接：带有限制性内切酶切点的一段人工D

24、NA片段。503)同聚物加尾法连接目的基因与载体DNA的体外重组4)平端连接：不同的限制性内切酶切割后的粘性末端，用适当的酶将DNA突出的末端削平或补齐成平末端；平末端连接效率低；所用ATP及T4连接酶的浓度比，粘性末端连接要高些(大于2.5倍)。51 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？思考与讨论基因A52受体细胞的选择原则1) 便于重组DNA分子的导入和筛选克隆子。2) 重组DNA分子在受体细胞内能稳定维持。3) 适于外源基因的高效表达、分泌或积累；对于真核目的基因，应具有较好的翻译后加工机制。4) 对遗传密码的应用上无明显偏倚性。5) 易于扩大培养或发

25、酵生长，具有较高应用价值和理论研究价值。6) 安全性高，不会对外界环境造成生物污染4. 重组载体引入受体细胞53(一) 原核生物细胞：如大肠杆菌、枯草杆菌、棒状杆菌、蓝细菌等。特点： 1) 大部分无坚硬的细胞壁，便于外源DNA导入； 2) 基因组小，遗传背景简单； 3) 多数为单细胞生物，易获得一致性实验材料； 4) 培养简单、实验周期短、重复实验快。常用受体细胞54(二) 真核生物细胞：特点：具备真核基因表达调控和表达产物加工的机制 1) 酵母单细胞真菌；基因结构简单；培养简单；外源基因表达产物能被分泌至培养基中；安全 2) 植物细胞全能性；有纤维素参与组成的坚硬细胞壁 3) 动物细胞常用受

26、体细胞551) 转化2) 转染3) 感染4) 其它方法重组载体导入受体细胞的方法56转化：由于外源DNA的进入而使细胞遗传性改变称为转化。感受态细胞：指受体细胞处于容易吸收外源DNA的一种生理状态，可以通过物理与化学方法诱导形成，也可以自然形成，在基因工程技术中通常采用诱导的方法。用于转化的受体菌细胞一般是限制-修饰系统缺陷变异株，以防止对导入的外源DNA的切割，用符号R-M-表示。限制修饰系统缺陷变异株：即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。1) 转化57重组DNA导入真核细胞的过程磷酸钙共沉淀法脂质体介导法电穿孔法：高压电脉

27、冲DEAE-葡聚糖法(内吞作用)显微注射法2) 转染脂质体58噬菌体进入宿主细菌，病毒进入宿主细胞中繁殖即感染。经人工改造的噬菌体活病毒作载体与目的序列重组在体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA包装成有活力的噬菌体或病毒以感染的方式进入宿主细菌或细胞感染效率很高，但DNA包装成噬菌体或病毒的操作较复杂。3) 感染59基因枪转化法激光微束穿孔法超声波处理法体内注射法精子介导法低能离子束介导转化法4) 其它方法605. 重组体的筛选和鉴定1) 遗传学方法2) 免疫学方法3) 核酸杂交法4) PCR技术5) 酶切鉴定61遗传学方法-根据标记基因筛选A)根据抗生素抗性基因筛选：含抗性基因的质粒转化

28、后，细菌在含这种抗生素的培养基中培养时，未被转化的细菌即被杀死，能生长的就是成功转化的；对于带有抗生素抗性基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。 例：四环素抗性基因tcr或tetr；卡那霉素抗性基因knr或kanr；链霉素抗性基因smr或strr；氯霉素酰基转移酶基因cat或cmrB)根据报告基因筛选：荧光蛋白基因；萤火虫荧光素酶基因；-葡萄糖酸苷酶基因。重组体的筛选和鉴定62抗生素抗性标记基因筛选原理63C)根据标志互补进行筛选：1) 转化进来的外源基因产物能够弥补受体株菌的突变缺陷型 受体菌his- 外源基因his+2) -互补：当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框

29、架改变，LacZ(-半乳糖苷酶)基因表达蛋白失活，产生的氨基酸片段失去-互补能力，含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。而没有重组质粒的转化子产生-互补，在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)存在下被IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。(蓝白筛选)在不含组氨酸的培养基中生长重组体的筛选和鉴定641. 基因工程的工具酶2. 基因工程的载体三、基因工程的基本工具65一、限制酶(restriction enzyme)：限制性内切酶酶的识别和切割位点：通常4-6bp，具有回文结构(palindrom)。1. 基因工程的工具酶1) 产生粘性末端(s

30、ticking end) 5-末端: EcoR 1: 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 3-末端: Pst1 : 5-CTGCAG-3 3 -GACGTC-52) 产生平末端(blunt end): Sma1: 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-566同功异源酶(isochizomers)：来源不同，识别和切割位点相同。 如：BamH 1 和 Bst 1同尾酶(isoaudamers)：识别序列不同，但产生相同的粘性末端。 如：BamH 1 ： GGATCC Sau3A 1： NGATCN基因工程的工具酶67二、修饰酶：对DNA 或RNA 末端进行剪切、补平、连接及化学修饰的酶

31、。1、DNA聚合酶 大肠杆菌中第一个发现，MW 109KD 还具有53及35外切酶活性2、逆转录酶 (reverse transcriptase)：以RNA为模 板合成DNA，构建cDNA文库3、T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase)：将3-OH 与5-P 连接形成3, 5-磷酸二酯键基因工程的工具酶684、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）：去除DNA or RNA 5-P，制备载体时可防止载体自身连接， 提高重组效率。5、末端脱氧核苷酰转移酶 末端转移酶 作用：在DNA的3-OH上，加上 dNTP6、Taq DNA聚合酶 和其它耐热DNA聚合酶 PCR时基因工程的工具酶69内切酶、碱性磷酸酶、连接酶的作用70本质：DNA，携带外源DNA进入受体细胞的运载工具。分类： 2. 载体 质粒 入噬菌体 粘性质粒 M13噬菌体 表达载体 大肠杆菌表达载体 哺乳动物表达载体克隆载体 按表达与否71大肠杆菌质粒载体 PBR322枯草杆菌质粒载体 PNC3酵母菌