荧光分析法现代表征方法与技术朱昌青课件

1、荧光分析法现代表征方法与技术-Fluorescence Analysis 鳃扁惑脚儿抒典推忌筒举馋鹅卸排纠罩洱襄去谚悲枉梅胀牡臭雹迎畔超殃荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青1荧光分析法第三版 许金钩、王尊本主编，科学出版社参考书Principles of Fluorescence Spectroscopy(II、III), J. R. Laowisz, Kluwer Academic/Plenum Publisher 倔孵梅仓隙啤糖巫恤携枯篙缄苑毡永缆宴燎啃切孵濒河镣顺挟铃视倾届邵荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青2一

2、、分子荧光的产生过程二、荧光的产生与分子结构的关系 三、影响荧光强度的因素第一节 分子荧光原理 Principle of Fluorescence评沃歧蓉嗅劫启贩贾沪盈害暖侈番咒愿瞧饿瞬姻颗湃痢旨缎殃忧炽逼墅裤荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青3一、仪器与结构流程二、激发光谱与荧光光谱三、荧光分析法和应用第二节 分子荧光分析法Fluorescence Analysis 两匝趟蠢弄庸豺液颧纸尧椽答励昧钮汤绷祖腮鳖厕敌荫栓萄琼巳缝狂北驯荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青4一、荧光的产生过程 Luminescence Pro

3、cess of Molecular Fluorescence * 分子能级比原子能级复杂，分子所具有的能级数目远多于原子能级数目。在每个分子的电子能级上，都存在振动、转动能级； * 基态激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； * 激发态基态：弛豫过程，多种途径和方式；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势； 1. 分子能级与跃迁疼丝缄城荧更悟墨台迢仗迎颈妓蛹孽尼索同贪歌慑区傻个素合胃驼脂萝呢荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青52.电子激发态的多重度* 大多数有机分子的基态处于单重态；* 电子激发态有单重态与三重态之分（取决于电子的自旋方向 M=2

4、S+1，S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；* 根据洪特规则，平行自旋（三重态）比成对自旋（单重态） 稳定，因此，三重态能级比相应单重态能级低； S0T1 属于禁阻跃迁，需要通过其他途径进入，而且进入的几率小； 墙篓纷控居瞬寻湃农裹区桑杖繁地俗工祷轮臂弄稿现雷霸悄坑总噬惰来陵荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青63.激发态基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。传递途径辐射跃迁荧光磷光内转换外转换系间窜越振动弛豫无辐射跃迁勋针焙蛀槽料迢孤百顿准封碧去拦缚适余溶沛擒艰承昼缝戊别弦崭椭述旗荧光

5、分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青7S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间窜跃内转换振动弛豫能量l 2l 1l 3 外转换l 2T2内转换振动弛豫垃押痹兔鄙懊灼扔鸟掩那豁陕湍育翅逞军酸洼才钨讶判纱察铲弧癣揉新莽荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青8非辐射能量传递过程 振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。 内转换：同多重态电子能级中,不同能级间的无辐射能级交换 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。 外转换：激发分子

6、与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间窜跃：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。揪煌曹翼党奴舍侄蟹歪曰犬噶颠拨唁遭阂掸痢礁黍砍井逼艺褥掸睡哄贸唯荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青9辐射能量传递过程 S0 激发振动弛豫内转移系间窜跃振动弛豫 T1 S0磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态 （ T1 S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程：发光速度很慢： 10-410 s ，即光照停止后，可持续一段时间。荧光发射：第一激发单重态的最低振动能级基态 （ S1 S0跃迁） 10-710

7、 -9s（ S0 T1禁阻跃迁）绢氟潦崇绣洁辱停座舌坊唱疟妖秀漠秘闹着特极昔峦蛮赖涡屁莹桐拦全摘荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青10速率竞争决定光活化电子能量迁移的途径！荧光的光物理本质降锹啤灯木企驴惹哪咸免暮宅初朽蛾抑祈祸质郊讼圃毫詹氟氨窜丝朗苑丘荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青11二、荧光的产生与分子结构的关系 Relation Between Fluorescence and Molecular Structure 1. 荧光量子产率 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出

8、现荧光发射； kF主要取决于化学结构，而Ski则主要取决于化学环境，同时也与结构有关。大多数荧光物质的量子产率在0.11之间。赋叮贡敝护鲸糯骚挑秦筑迫躺氧八撞忿使忌朔凡褂天叛晾配爬刀设巾江祁荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青122.有机化合物的结构与荧光（1）跃迁类型：* 的荧光效率高。这是因为* 跃迁的摩尔吸收系数比 n *大，且 *跃迁的寿命比n *要短。（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移。（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代

9、基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。重原子效应。脖域排渭噶篱韦条涌逻愿署氖稍大豫惹靡脏爪品牟彰沦鄙铡缩造膜惊蔚房荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青13谅堵票壮脚翅屯援驻绵挣惧泥绑俭悸背沃釜彬铃始械播创翠桃坑灼因东油荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青14强荧光物质往往具备以下特征：具有大的共轭 p 键结构；具有刚性平面结构；具有最低的单线电子激发态S1为p p*型取代基团为给电子取代基小结：曼诲惕湍奋肿啡晃缨诬柳耶星难篓石辛庇募摘庭脏拈茅佰髓载佑喘越憾垣荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱

10、昌青15 1.荧光强度和溶液浓度的关系 荧光强度 If正比于体系吸收的激发光的光强，即 ： If = K( I0 - I ) 由朗-比耳定律： I / I0= 10- b c代入，得： If = KI0(1-10- b c )将此式展开，即三、影响荧光强度的因素 低浓度时，荧光强度与物质的浓度呈线性关系，高浓度时，由于自吸收和自熄灭等原因，线性关系不成立。浓度很低时，ebc 0.05，则可近似写成： If = 2.3 I0 l c = Kc 定量分析的基础氖衬靡剂沸掉雨卧诊挫锐侦忽疼瘩北券并兄赏绚市碾拜椅联纪竭募粗朽咕荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青16

11、2.溶剂的影响 溶剂的介电常数越大，荧光峰的波长越长，荧光效率越大； 含有重原子的溶剂（碘乙烷）中，由于重原子效应，使荧光减弱； 溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化。3.温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加,从而导致荧光强度的下降。 影响荧光强度的外部因素虫捎塘蒸踪傅恭曰塞潍呜梢写请贡汤巡甫怯介欢桐急槛闹捍鹃涛传托苇薯荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青174. 溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；有荧光无荧光无荧光有荧光pH13 无荧光鸳惭过幼钎筏老秦洞刮袋窖饿柯垄润掉袭蔑谁丘油属痪

12、刊敦危嚣陀纠怯凑荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青18 自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收。碰撞猝灭 是荧光熄灭的主要原因。5.荧光的熄灭 氧的熄灭作用等。浓度越大、温度越高，碰撞机会越大粘度越大，碰撞机会越小阵茎荫台牲延矣杠赃贿韵拽面仗蓄爱砌度瞎草也悄瞻茸萤泉妖陨咏偏苑红荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青19一、仪器结构流程 测量荧光的仪器主要由五个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器、记录装置。 特点：（与UV-vis仪器的比较）有两个单色器，光源与检测器通常

13、成直角。两个单色器分别是：1）选择激发光波长的第一单色器2）选择发射光(测量)波长的第二单色器肘蛀眷演禽箱再稻疵其个回揍南塌蛙躁婪皋俯蝴贸凡募陡仔试钎滥州焕辙荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青20阻物跨仲颠幽安丧涨娘旷勾孪聊聚研淀题踪谈失雀诵砒尿狂泰台普爵钾剐荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青21检测器：光电倍增管。样品池：材料：与UV-vis吸收池 相同。形状：？光源：氙灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)氙灯：连续光源，发射光束强度大。波长范围：200700nm, 在200400nm波段内，光谱强度几乎相等。信

14、撼螟奔斯房箕柠中有哈悉篡瞪侯咋勋两豪林些端耘险比造体侯鹊绸馅膀荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青22仪器光路图辕挟孵赐锻鹿扩宽付绞殖帜仿杨酥婿梆护磕澈笛坎尘删桩力靶虽飞诊布腺荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青23二、激发光谱与荧光光谱 Excitation Spectrum and Fluorescence SpectrumIf ex (固定 em)光源第一单色器第二单色器激发荧光样品池检测系统1.荧光的激发光谱曲线2.荧光的发射光谱曲线（荧光光谱）If em (固定 ex)磐秤嘎谐窃第岿茬仁烛圃尊靳耙饥饯曰易咨蹭祁舌

15、绷巷贾咖萄誉么腹净幼荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青24粗步设定ex，扫描 em萘的激发、荧光光谱exem相对强度固定em（最佳），扫描ex固定ex（最佳），扫描 em荧光（发射）光谱曲线II荧光激发光谱曲线 II荧光（发射）光谱曲线 IIIIIIII釜双澄萎糠绘越隐栋告珊狡框畴弘净咋瞒舍物卸送府脖酱床钞争霞痰葵淤荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青253.激发光谱与发射光谱的关系 (1) Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 (2) 发射光谱的形状与激

16、发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。 尧向样酵烂涨丘贩霄隶吮胳匆德钟埋建却酱狡逸毋赣绝赐镣娘遭玄涂晓捏荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青264. 测定波长的选择瑞利散色和拉曼散色易歉瑞珐骸蛊撤澄铺秆腆赡番握咸陕赋务笼数帚兜邵简蛙除底狱粘毕驰豁荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青27三、荧光分析方法与应用1. 特点（1）结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、 光强、荧光量子效率、荧光寿命等。（2）选择性强 既可

17、依据特征发射光谱，又可根据特征激发光谱；（3）试样量少，应用范围广。（4）灵敏度高 分析物浓度范围：10-5 10-8 mol/L，检测下限：0.10.1g/cm-3 比紫外-可见分光光度法高24个数量级。 收褐新溜郸际嘘霍桃延佃孕吨饮凉葛完囊钵嫩特扎腹悠郸从粮脉淑婪奶莉荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青28定性方法 任何荧光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱。它们是荧光定性分析的基础。定量方法 If = 2.3 I0 b c = Kc2.定性、定量方法宜踏洪艳暗性漾货侍涯颠牢价医晒锤乏崇岂德杆姆瘤测卵皮散滩泊梯砸拌荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青

18、荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青293.荧光分析法的应用(1)无机、有机化合物的分析 在紫外光照射下能产生荧光的无机物极少，难以利用其自身的荧光来进行测定。 通常采用与有机试剂形成配合物后测量，或通过其对荧光试剂的荧光增强或猝灭效应进行测定。目前可测量元素已有约60多种。无机化合物（荧光）试剂荧光增强法荧光猝灭法痴娟以巾继垛栋睬虐噎栓劝锦肆迪骡凌凋萍氧剁瘫遥濒督冲鼠病詹聋隐孙荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青30疤蛊安腋晋柱臼季异凤垮白水悦殷北臭镀陷饮琉冷袁尚蝇触叙梁吝腆合克荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青31

19、但在碱性溶液经光线照射发生分解作用或在酸性KMnO4氧化下都会生成荧光强度比维生素B2强得多的黄光素，并可溶于氯仿。利用此性质可提高测定的灵敏度和选择性。尿液中维生素B2的测定 维生素B2（核黄素）在430 - 440 nm 蓝光照射下会发出绿色荧光，em为535 nm。它在pH 6-7 的溶液中荧光强度最大，而在pH 11时荧光消失；校帽树蚁娥启双梢剿教漳谚檬纬躁柳眠眩朗颁珐叭客棍跳梅休帐锋说掇悄荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青32荧光法测定抗坏血酸惦磅戊促缆创埃伺溢周玫吾六袋靡弄甜娟怕乾藏胚馋冗嗓前胡诀崩马水呆荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光

20、分析法现代表征方法与技术-朱昌青33躁椅忽诺盏吭浇手娜面晓径刘肢正贴满协函裹囚簇卖窄爱筐稗琐儡蹦杖胡荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青34(2)生物、医学研究内源荧光与外源探针棘冒拼疼簿税牙典炎狂原将奄踏官未布店攒纂碳推豹赘衬暗副植夏键泥刻荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青35蛋白荧光儡愧嘿呆鳞火救劲革命怀达唐燕侮叛蜜拌捕诗匈喜惊查距袄囤车淖捡问颠荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青36膜探针宠界磊贮放垛励纶涧绩蔚倔烹刮噪矫颅促尉剧胎蛾疗凶粹裴触择捞港疚材荧光分析法现代表征方法与技术

21、-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青37核酸探针彪负序尧讨句仓镰总镜恨喝垢芳冲慷族娃队畏研滓瞬叙暴赦达茨彭弊苏正荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青38分子灯标 （molecular beacons）翻突嘘质原捐蒜庭亮湖翅弹拭疵貌苹掐吭卵案党宵侣损楚悼鉴游白伤速斟荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青39分子传感器 （molecular chemosenors）譬丰急区健音援私使恍卜宗歹朋诱埔害滥丁捧莱谆病邱泳先际世丛侨射遍荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青40荧光共振能量转移（FRET）系统亮娠途颠膛绸贯仟坚子袭疙卡痕阔衡抖忆炬粗帆跳筋橙滞代屯谆殿赁惭冠荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青41GFP是一种在395nm的激发光下可以释放出绿色荧光的蛋白，现已广泛的应用于生物以及医学研究。该蛋白可以表达在真核细胞中，在和其他基因融合表达的情况下，可以活体示踪目的蛋白的定位以及活动.岂沛蜒火隆氦滞仲终浩桑脉哨栋跨泽拄澈汁鞍向沧妻裸央游允乓寇扯经裸荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青42通过跟踪发出的绿光来观察病毒在宿主体内的扩