细菌生长曲线

1、菌生畏曲之浏J定 Exp 11. Turbidity of bacteria、目的：在逵行务田菌生畏曲之测定前，必殖先了解U-2001 Spectrophotometer 操作方法，才能将菌的敷量以吸光值的方式表示出来。二、原理：弓青言羊整理 p. 90-92，孥畲整 Optical density （O.D.）【Exp 13.畲 用到】。三、器材：culture ：（每鲍）24 hr Escherichia cQbrioth）medium :（每鲍）Nutrient brothequipment :1 ml pipette , pipette aid , cuvette，拭箓左氏，康菌液杯，

2、装蒸水的洗 瓶，诚菌空营式管 ,U-2001 Spectrophotometer，振谡器。四、M步骤*由助教先示氧操作方法，再由孥生自行操作舆测量待测液之吸光值。了解 U-2001 Spectrophotometer 操作方法：温檄的15分童。MENU t （主目靖 S 1. Photometer t 翰入波畏 600 nm 及 ABS Forward tNutrient broth 厚帚零 autozero t （刖、转二支 cuvette） *】取出彳麦面之cuvette，倒入待测液2，等到右上方敷撮穗定彳麦，按 下Start t菁己。* 1 cuvette有石英管（测波畏340 nm以下

3、）、玻璃管、塑膝管等材 ,本W，使用塑膝材之比色管。*2每次测定前需先用蒸水滴洗cuvette , 再以待测液润凛，倒掉，再装入待测液，测完倒掉，用蒸水滴洗。测定之前Gen. Microbiol. Lab., 2008 Dept. Agri. Chem., NTU cuvette 殖用拭箓纸擦乾，手握管的非透明虔；康菌液言青滴洗入 康菌液杯中，集中虔理)。每鲍取一管助教所率脩之E. coli富待测液，隙演 U-2001 Spectrophotometer操作，测出其原液O.D.【Exp 13.将畲利用到此操 作，故殖熟悉其操作步骤】。 Exp 12. Serial Dilution-Agar

4、Plate Procedure to Quantitate Viable Cells、目的：孥晋速稀释法。察活菌敷。二、原理：微生物目之菁十敷法有：直接微箓言十敷(Direct Microscopic Counts):以 Petroff Hauser chamber 着十敷。僮着十敷微量菌液，再由敷孥方 法求取菌敷，此法迅速方便但活舆死菌皆涵瓷之且菌敷若 低於一百蔑日寺，率碓度差。雷子务田胞言十敷器(Electronic Cell Counters):如 Coulter Counter , 此法不能匾分活或死菌，也照法匾别惰性颗粒物舆胞物 Mo化孥方法(Chemical Methods):以冏

5、接测定蛋白M澧度、DNA 走量、胞M量及代物等反推菌敷。分光光度言十分析(Spectrophotometric Analysis):利用穿透菌液之 光量，随菌量增加而咸少。此法迅速但菌敷若低於一千蔑日寺，敏感度差。速稀窿洋菜平板法(Serial Dilution-Agar Plate):此法乃言十敷活 菌。_利用照菌水望寸菌液做一速串稀释，探Pour Plate法迤行之， 经隔夜培餐彳麦言十敷(或者使用Quebec，参考本Figure 21.4, p. 89)o本a中输裂田菌生畏曲之方法便是利用速稀释-洋菜平板法， 故Exp 12舆菌生畏曲之测定一饼逵行。 Exp 13. The Bacter

6、ial Growth Curve一、目的：了解务田菌的族群生M,M生畏曲 (growth curve)，业求出增代 日寺冏(generation time)。二、原理：田胞的生畏：将田菌接椒在液熊培餐基中，置於其最遹璘境下(最遹 温度、pH及Mm成)培餐，则可求出一务田菌生畏曲。务田菌之生 畏曲可分成以下敷侗日寺期：理滞期(lag phase) 3田胞正在遹JS新璘境，敷目照明增加。望寸敷期(log phase) 3田胞生畏快速，敷目呈畿何级敷增加。静止期(stationary phase):因餐分耗盍、代康物的堆稹田胞分 裂舆死亡速度相富，故其目不增加。死诚期(death phase) 3田

7、胞快速死亡，敷目呈畿何级敷下降。生畏曲之测量：可用pour plate法，直接求得活胞敷目，或是用 分光光度菁十值法，冏接推沏临田胞生畏量。之彳麦在半望寸敷方格纸上 作毒generation time 的旨十算：段粗略的菁十算(分光光度菁十结果):t (O.D. 2n) t (O.D. n)GT：generation time直接务田胞敷目的言十算(pour-plate之结果):厂丁 -t log 2GT - ；:；log b log BB ：在log phase上一黑占的胞敷目。b :在log phase上另一黑的胞敷目。t : B黑舆b黑的冏隔日寺电三、器材：culture :（每鲍）12

8、 hr Escherichia colimedium :100 ml BHI 1瓶（棉花三角瓶）99 ml照菌水18瓶（稀释牛奶瓶）400 ml NA 1 瓶（放於 50C Water Bath 中）Equipment :（每鲍）37C shaker incubatorU-2001 spectrophotometerpetri dishes 24 固micropipettes1 ml 舆 200pl micropipette tips （诚菌盒中）诚菌空营式管6支cuvette 1 支安全吸球10 ml sterilized pipettes 6 支菁十日寺器（自脩）、康菌液杯、拭箓纸、装蒸水

9、的洗瓶、振谡培餐箱。四、事步骤1票示工作：（班别、，鲍别、日期）& （每固t有3固稀诲即10-2,照菌水：t , t 0 , t60 , t90 , t ,10-4,10-6 故共有 6X3 = 18 瓶）petri dishes :每固 t 票示有 10-4 , 10-5 , 10-6 , 10-7 故共有 24 固。2.流程：（参照 Fig. 21.1）la.取 5 ml 的 log phase E. coli culture 到 100 ml BHI broth，测 600 nm 下之O.D.值，着己之兰登於黑板。（舄t）lb.取1a. 0.1 ml到9.9 ml照菌水稀释瓶中t lc.

10、取1b. 0.1 ml到9.9 ml照菌水稀释瓶中t t10-2。10-4。10-6。 1b. - 1d. mixing sample 的方法弓青参考本 Figure 21.3, p. 89。使用安全吸球青小心，玻璃pipettes及pipette tips用完彳麦青分别丢 入回收桶中，待下彳麦一饼诚菌清洗或丢窠。2a.取 1c. 1 ml 做 pour plate x10.1 ml 做 pour plate tt t , 10-4。t0 ,10-5。ld.取1c. 0.1 ml到9.9 ml照菌水稀释瓶中t t0Gen. Microbiol. Lab., 2008 Dept. Agri. C

11、hem., NTU 2b.取 1d. 1 ml 做 pour plate t t0 ,10-6。0.1 ml 做 pour plate t t , 10-7。完成2a.的plate待凝固倒置培餐37 C, 24hr彳麦普己菌敷业登於 黑板2。It 1a.已做完 1b.放入 shaker 120 rpm 37C, 30 分童潟t 切。测O.D.。饵己之业登於黑板)x430重覆1b.2b.重覆3.德t )其它t , t60 , t依此推。90120150 100 ml BHI三角瓶，每一次完成30分童的培餐彳麦，於测O.D.前， 可先取出5 ml於诚菌空管中，三角瓶焉上再放入 shaker inc

12、ubator 中 培餐，以筋省日寺冏，之彳麦再分别逵行测O.D.及稀释工作。康液丢在 稀释遏不用的牛奶瓶中。洪1倒plate日寺，培餐基量的2/3圆面稹，倒完焉上瓷瓷子业前彳麦左右各 事堑摇3次，使培餐基充满於petri dish底部，但需小心勿将培餐基 摇出碰到瓷壁。淤2菌敷若舄TNTC或TFTC也言青算出的略菌敷。(一固plate可接受菌 落菌敷在30 - 300固之冏)淤3 100 ml BHI三角瓶的culture，需於放入shaker incubator彳麦才能 始汨寺。淤4 O.D.若 0.6青稀释再测，稀释倍敷需菁己繇(O.D.值在0.10.6 之冏段可信，舄在性氧圉内)K5 cuvette 回收。* wa的察注意事项：wa结果之务己法：TNTC (too numerous to count):每固 plate 菌落敷大於 300 固，青重 匾域的略算出菌敷,登菁己如下： TNTC (1256)。TFTC (too few to count):每固plate菌落敷小於30固，青算出菌敷， 登菁己如下：TFTC (12)。每固培餐日寺冏黑占殖至少有一固plate菌落敷在30-300内，如t的10-630稀释度有40固菌落则登菁己舄40X106，若有二固plate菌落敷在30300 内则殖明