离子色谱法测定乌拉胆碱

1、离子色谱法测定乌拉胆碱摘要：乌拉胆碱是一种季铵盐化合物，作为神经系统疾病用药，可注射或片剂口服。本文采 用离子色谱方法代替传统的重量分析方法，简单方便重现性好。不但可以同时分析乌拉胆碱 及其水解产物，且各项方法参数均优于现有指标，线性范围可达4个数量级，方法准确、可 靠，适于推广。关键词：离子色谱，乌拉胆碱，水解物，IonPacCS14分离柱刖曰胺类在不同的工业中广泛应用，如化学工业、制造业、电厂和制药工业。在制药工业中， 胺类能够用于乳化剂和药物生产。乌拉胆碱，2-(甲酰胺基)氧-N,N,N-三甲基丙基氯化铵， 是季铵盐化合物，在结构和药效性上与乙酰胆碱有关，可注射或片剂口服用于闭尿治疗。美

2、 国药典(USP)方法24 NF 19 (第230页)最近建议，乌拉胆碱的重量分析方法可以用选择性更 强的离子色谱分析方法代替1。这个方法用IonPacCS14分离柱分离，手动配制20 mM MSA 为淋洗液，而后抑制型电导检测。本应用注解中MSA淋洗液由EG40电解在线产生，使得 重现性非常好，而且方便，不同实验室之间容易重复。我们讨论了方法的检测限(MDLs)、 测定过程中乌拉胆碱及其降解产物(2-羟基三甲基丙基氯化铵，2-HPTA)的潜在干扰。实验部分Dionex DX 600，包括：GP50梯度泵、ED50A电化学检测器、EG40淋洗液发生器、 EluGen.EGC-MSA罐、AS50

3、自动进样器、AS50柱温箱带电导池Chromeleon.6.4色谱工作 站。试剂和标准17.8 MQ cm去离子水、六种阳离子混标溶液-II、氯化乌拉胆碱(U.S. Pharmacopeia)条件分析柱：IonPac CS14阳离子交换柱 4 mm x 250 mm保护柱：IonPac CG14阳离子交换柱， 4 mm x 50 mm柱温：30 C淋洗液：20 mM MSA，通过EG40产生流速：1 mL/min进样体积：25p检测器：抑制型电导检测，CAES.抑制器，抑制电流为67 mA预计反压：2100 psi预计背景：0.2 p S运行时间：15 min溶液和试剂的准备试剂水水的电阻率应

4、在17.8 MQ cm以上，用前过0.2-p m膜。淋洗液向EG40 (带EGC-MSA罐)泵入水，在线产生20 mM MSA淋洗液。Chromeleon软件 能够追踪MSA的使用量并计算剩余的使用时间。当剩余的使用时间降至10%以下后，更换 EGC-MSA罐。也可以手动配制20 mM MSA淋洗液。取50 mL 0.4 N MSA浓林洗液，用去 离子水稀释至1.0 L。超声脱气10min。将淋洗液保存在塑料容器中。或者称取96.10 g MSA 固体(MSA, 99%)，用500mL去离子水溶解配制成1.0 N的存储溶液。取20 mL 1 N MSA 浓林洗液，用去离子水稀释至1.0 L。超

5、声脱气10min。将淋洗液保存在塑料容器中。标准存储液1000 mg/L乌拉胆碱标准溶液称取0.050 g乌拉胆碱固体，溶于50.0 g去离子水，保存在塑料瓶中，超声溶解混匀。1000 mg/L 2-HPTA 标准溶液称取0.050 g乌拉胆碱固体，溶于50.0 g去离子水，保存在塑料瓶中。加入50 mL 0.1 N NaOH，超声溶解混匀。五天后乌拉胆碱会完全水解生成2-HPTAo标准工作液用去离子水将存储溶液稀释相应倍数，得到不同浓度的工作溶液：0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 500, and 1000 m

6、g/L。2-HPTA 的最高浓度为 500 mg/Lo系统的准备和建立CAES抑制器的水化：在“Eluent-In”和“Regen-In” 口各注入3mL去离子水，约放置 20mi后，抑制器可以完全水化。要了解CAES操作的更多信息，请参考Installation and Troubleshooting Instructions for the CAES (Document No. 031770-02),安装EG40,连接入网络，用Chromeleon色谱数据系统进行配置。参考EG40操作手册 调节EluGen MSA罐，以1.0 mL/min流速运行梯度，前20 min将MSA的浓度从1改变

7、到 60 mN，然后以60 mN运行40 min。在EluGen罐调节期间，去掉安装的0.005 in. PEEK反 压管。安装4 X 50 mm IonPac CG14保护柱和4 X 250 mm IonPac CS14分析柱。确保系 统反压大于2000 psi (20 mM MSA，1.0 mL/min)，因为EG40上安装的高压脱气管要求至 少2000 psi (14 MPa)的反压以有效除去淋洗液中的氢气。如果必要，则安装EG40备件箱里 的反压管使系统反压在20002800 psi。因为系统反压会随时间而增大，有必要经常割短反 压管以保证系统反压在3000 psi以下。不要超过300

8、0 psi压力工作。以20 mM MSA，1.0 mL/min平衡CS14柱60 min。分析前，用去离子水作系统空白。配制500倍稀释的六种阳 离子标准溶液，25-p L满环进样。然后，配制5 mg/L乌拉胆碱和2-HPTA的混合标准溶液，25-p L满环进样。如果两次 进样的保留时间重现，说明系统已经平衡。峰面积的精密度和准确度与自动进样器的性能有关。每天更换冲洗容器中的水，用新鲜 过滤和脱气的去离子水。每天检查AS50，看样品注射器和管路中有无气泡。AS50的精密 度和准确度与进样模式有关。最准确的进样方式为满环进样。为了节省溶液，可以部分环进 样。结果与讨论在碱性溶液中，乌拉胆碱可以水

9、解成2-HPTA。本应用注解中，在乌拉胆碱溶液中加入 0.1 N NaOH，放置五天后可生成其水解产物。图1是第一天和第五天，9.5 mg/L乌拉胆碱水 解成2-HPTA的色谱图。为了测试系统对乌拉胆碱及其降解产物2-HPTA的适用性，我们同 时测定了六种常见阳离子，如图2所示。USP方法报道的Na+, Mg2+, Ca2+, 2-HPTA和乌拉 胆碱的相对保留时间分别为1.0, 1.4, 1.6, 2.0和2.8。本应用注解中则分别为1.0, 1.3, 1.5, 2.0 和2.9。根据参考文献1，钙离子和2-HPTA的分辨率应大于2,乌拉胆碱的峰效应大于350 理论塔板数，峰的拖尾因子应小于

10、4.5。本应用注解的相应值如图2所示分别为4.66, 2189 和 1.29。表1总结了乌拉胆碱和2-HPTA的线性范围和检测限。校正曲线的线性范围为四个数量 级，线性相关系数分别为2-HPTA 1.0000，乌拉胆碱0.9999。一天内七次进样的重现性为 0.31%，四天内88次对不同浓度的溶液进样，保留时间的RSD为1.6%。保留时间的重现性 主要由于EG40在线产生的MSA淋洗液纯度高。与手动配制淋洗液相比，EG40自动化程 度高，操作误差小，精密度高。F卯岭L Z-HFIA 9 & TOLL 快th涧echo ir-/m1.2-HPT41.1 mg4隽山MS 95Figurel.Con

11、version of Bethanechol to 2-HPTA in the presence of NaOH.C AhmikiPm (GH ur) C-询E侦时20 HIM MSAEluent 顷捉:EG40rl-f rfi? IFF W Rrlt敦1 rriL 加 inlg Volurec1Mecliixi:冷叩pre坚td crndudivi 1 CAESSample Prep:Pi叩由讪 hi Q 1 N HaOHColumn: Eljent:11 hh : ; jr-?： lemperaiure: FI av Ra(t: Irj. VolurnsDMKtion：如 CGI 4 如。

12、$1420 mM MSAEG4050 FI ml ruin2511supcr 瞄 E conductivity, caes1 LithiumZ Sodo & Amnxjnium 4 Pchssium 5. Maggum 权 Calcium L2-HPTA fi. lhi)npKlreals：1 j fiy,F七TIIIil0* c, FS.*J7 51*JI)1芸EMi lUlm* Hie MDLs were calculated as MDL- x (S) Where t - Student s rvalue for a 99% confldme level and a standard d

13、eviation estimate with n -1 degrees of freedom (t - 3.14 for seven replicates oftfie MDL Standard) and S - standard deviation of the replicate anafysis.Figure 2. Separation of Bethanechol and 2-HPTA from common morganic canons using the lonPac CSI4l?.O12-HPTA0.02-5001.00000.0060.02CationBethanechol0.02-10000.9999Linearity (r2)Ca tculated MDL* (mg/L)MDL Standard (mg/L)Table 1. Linear Range and MDLs for Bethanechol and 2-HPTA小结本应用注解讨论了用IonPacCS14分离柱分离(20 mM MSA为淋洗液)抑制性电导检 测乌拉胆碱和2-HPTA的方法。这两种在制药上有重要意义的胺可以与可能被用作非活性成 分的常见阳离子分离。由于使用EG40在线产生MSA淋洗液，这两种化合物保留时间的天 重现性非常好。附录USP的方法50-p L进样可测定浓度高达1