微生物学实验讲义

1、.：.；2021级基地班任课教师： 熊 芳教学时数： 15学时实验周数： 4周 生物学实验教学中心微生物实验目录15学时微生物实验根底知识引见实验一：培育基的配制与灭菌4学时实验二：土壤自生固氮菌的分别纯化5学时实验三：显微镜的运用和简单染色3学时实验四：革兰氏染色和荚膜染色3学时第一次实验：微生物学实验根底知识一、实验目的1.熟习实验室规那么和平安守那么，正确应对实验中出现的不测事故；2.认识微生物学实验室常用仪器和有关试剂的根本知识；3.掌握实验报告的正确书写。二、实验内容1.实验室规那么；2.实验室平安守那么；3.实验室中不测事故处置；4.常用器皿及器具；5.显微镜及有关知识；6.实验预

2、习、实验记录和实验报告。实验一 培育基的配制和高压蒸汽灭菌配置培育基的根本流程如下：原料称量溶解调理pH值过滤廓清分装塞硅胶塞和包扎灭菌培育基的配制原那么一、营养成分1. 根据不同微生物的营养需求配制不同的培育基，如自养型微生物的培育基完全可以或应该由简单的无机物质组成。异养微生物的培育基至少需求含有一种有机物质。碳源物质的功能：构成细胞物质；为机体提供整个生理活动所需求的能量异养微生物。氮源(nitrogen source) 凡是提供微生物营养所需的氮元素的营养源，称为氮源。氮源物质的主要作用是合成细胞物质中含氮物质，少数自养细菌能利用铵盐、硝酸盐作为机体生长的氮源与能源，某些厌氧细菌在厌氧

3、与糖类物质缺乏的条件下，也可以利用氨基酸作为能源物质。能源 指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。2. 留意各种营养物质的浓度与配比 营养物的浓度：在普通情况下，浓度适宜的营养物质才对微生物表现出良好作用，浓度大时对微生物生长起抑制造用，浓度小时不能满足微生物生长的需求。 各营养物质之间的浓度比：培育基中各营养物质之间的浓度比直接影响微生物的生长与繁衍和或代谢产物的构成与积累，尤其是碳氮比CN碳氮比普通指培育基中元素碳与元素氮的比值，有时也指培育基中复原糖与粗蛋白两种成分含量之比的影响更为明显。二、控制培育基的PH值 各类微生物生长的最适pH各不一样，细菌与放线菌生长的pH在

4、7-7.5之间，酵母菌与霉菌生长的pH值在4-5之间。 在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的构成与积累，常会改动培育基的pH值，为了维持培育基pH值的相对恒定，通常采用以下两种方式：内源调理：在培育基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调理培育基的碳氮比。外源调理：按实践需求流加酸或碱液三、浸透压留意营养物质要有适宜的浓度，不能太低满足不了生长的需求，太高那么浸透压太大，也会抑制微生物的生长四、氧化复原电位氧化复原电位越高，培育基的氧化活动越强，在厌氧菌培育中，参与复原剂，可降低自在氧的毒害。培育基的种类据组成成分可分为:1.合成培育基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。是

5、一类按微生物的营养要求准确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培育基。如葡萄糖铵盐培育基、淀粉硝酸盐培育基等。2.半合成培育基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。例如，马铃薯蔗糖培育基。 3.天然培育基：利用天然来源的有机物配制而成。如牛肉膏蛋白胨培育基、麦芽汁培育基等。从培育基的物理形状可分为1.液体培育基：不加凝固剂常用凝固剂为琼脂的液体形状培育基。2.固体培育基：在液体培育基中参与1-2%左右的凝固剂的固体形状的培育基或农副产品培育基。 3.半固体培育基：在液体培育基中参与0.20.5%凝固剂而成的半固体状培育基。按照培育基的用途，可将其分为1.加富培育基：加富培育基是指在普通培

6、育基里加过血、血清、动物或植物组织液或其他营养物质或生长因子的一类营养丰富的培育基，用以培育某种或某类营养要求苛刻的异养微生物。2.选择培育基：选择培育基是根据某种或某一类群微生物的特殊营养需求或对某种化合物的敏感性不同而设计出来的一类培育基。利用这种培育基可以将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分别出来。3.鉴别培育基：普通培育基中参与能与某种代谢产物发生反响的指示剂或化学药品，从而产生某种明显的特征性变化，以区别不同的微生物。牛肉膏蛋白胨培育基的制备实验原理牛肉膏蛋白胨培育基是一种运用最广泛和最普通的细菌根底培育基，有时又称为普通培育基。由于这种培育基中含有普通细菌生长繁衍所需求的最根本

7、的营养物质，所以可供作微生物生长繁衍之用。根底培育基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl.其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。在配制固体培育基时还要参与一定量的琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下96时溶化，实践运用时，普通在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培育基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。由于这种培育基多用于培育细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH值调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁衍。牛肉膏蛋白胨培育基的配方如下：牛肉膏 3.0g蛋白胨 10.0gNaCl 5

8、.0g水 1000mlpH 7.47.6。实验器材溶液和试剂 牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/LnaOH，1mol/LHCl。仪器或其他器具 试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培育基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸pH5.59.0，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳/皮筋，纱布等。操作步骤称量：按培育基配方比例依次准确地称取牛肉膏，蛋白胨，NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或外表皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。溶化：在上述烧杯中先参与少于所需求的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热，或在磁力搅拌器上加热溶解。将药品完全溶解后，

9、补充水到所需求的总体积，假设配置固体培育基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在制备用三角瓶盛固体培育基时，普通也可先将一定量的液体培育基分装于三角瓶中，然后按1.5%2.0%的量将琼脂直接分别参与各三角瓶中，不用加热溶化，而是灭菌和加热溶化同时进展，节省时间。在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培育基因沸腾而溢出容器。同时，需不断地搅拌，以防琼脂培糊底烧焦。配制培育基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培育基中。调pH在未调pH前，先用精细pH试纸丈量培育基的原始pH值，假设偏酸，用滴管向培育基中逐滴参与1mol/LNaOH,边加边搅拌，并随时用pH试纸测其

10、pH，直至pH达7.6。反之，用1mol/LHCl进展调理。对于有些要求pH较准确的微生物，其pH的调理可用酸度计进展。pH不要调过头，以免回调而影响培育基内各离子的浓度。配置pH低的琼脂培育基时，假设预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，那么琼脂因水解而不能凝固。4、过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的察看。普通无特殊要求的情况下，这一步可以省去。5、分装按实验要求，可将配置的培育基分装入试管内或三角烧瓶中。液体分装 分装高度以试管高度的1/4左右为宜。分装三角瓶的量那么根据需求而定，普通以不超越三角瓶容积的一半为宜，假设是用于振荡培育用，那么根据通气量的要求酌情减少；有的液体培育基在

11、灭菌后，需求补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，那么装量一定要准确。固体分装 分装试管，其装量不超越管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的量以不超越三角瓶容积的一半为宜。半固体分装 试管普通以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。分装过程中，留意不要使培育基沾在管瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。加塞 包扎：加塞后，将全部试管用麻绳/皮筋捆好，再外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿塞，其外再用一道麻绳/皮筋扎好。用记号笔注明培育基称号、组别、配置日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结方式扎好，运用时容易解开，同样用记号笔注明培育基称号、组别、配置日期。有条件的实验室，可用市售的铝

12、箔替代牛皮纸，省去用绳扎，而且效果好。灭菌：将上述培育基以0.103Mpa,121，20min高压蒸气灭菌。搁置斜面：将灭菌的试管培育基冷却至50左右以防斜面上冷凝水太多，将试管口端搁在玻棒或其他适宜高度的器具上，搁置的斜面长度以不超越试管总长的一半为宜。无菌检查：将灭菌培育基放入37的温室中培育2428h，以检查灭菌能否彻底。阿斯毕无氮培育基甘露醇或蔗糖、葡萄糖 10gKH2PO4 0.2gMgSO4.7H2O 0.2gNaCl 0.2gCaSO4.2H2O 0.1gCaCO3 5g琼脂 20g水 1000mlPH 7.07.2 121 灭菌30分钟高压蒸汽灭菌一、目的要求1了解高压蒸汽灭菌

13、的根本原理及运用范围。2学习高压蒸汽灭菌的操作方法。二、根本原理高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，经过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后封锁排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而添加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而到达灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效能比干热大，其缘由有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量添加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100时，由气态变为液态时可放出226kJ千焦的

14、热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而添加灭菌效能。在运用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除能否完全极为重要，由于空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。实验室中常用的高压蒸汽灭菌锅有立式、卧式和手提式等几种，其构造如图。本实验引见手提式和立式高压蒸汽灭菌锅的运用方法。三、器材牛肉膏蛋白胨培育基，阿斯毕无氮培育基，培育皿，立式高压蒸汽菌锅等。四、操作步骤1首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内参与适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。2放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。留意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果

15、。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。3加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。4用电炉或煤气加热，并同时翻开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力添加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用 105kg/cm2，1213，20分钟灭菌。5灭菌所需时间到后，切断电源或封锁煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，翻开排气阀，旋松螺栓，翻开盖子，取出灭菌物品。假设压力未降到0时，翻开排气

16、阀，就会因锅内压力忽然下降，使容器内的培育基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，呵斥棉塞沾染培育基而发生污染。6将取出的灭菌培育基放入 37温箱培育24小时，经检查假设无杂菌生长，即可待用。五、实验报告1结果检查培育基灭菌能否彻底。2思索题1高压蒸汽灭菌开场之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌终了后，为什么要待压力降到0时才干翻开排气阀，开盖取物？2在运用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不平安的要素？第二次实验：实验二 土壤自生固氮菌的分别和纯化一、实验目的：1、学习微生物的纯系分别、培育方法；2、掌握稀释分别、划线分别、涂抹分别纯化微生物的方法。二、根本原理： 为了消费和科学的需求，往

17、往需求从自然界混杂的微生物群中分别单一的菌种，这种获得单一菌株纯培育的方法称为微生物分别。为了获得某种微生物的纯培育，可采用以下两种方法：一种是提供有利于该微生物生长繁衍的最适培育基及培育条件。如要从土壤中分别自生固氮菌，那么培育基中是不能含有N源，这种培育基就比较适宜能利用空气中N2的微生物。另一种方法是在培育基中参与某种化学物质，以抑制人们不需求的微生物的生长繁衍。分别土壤中的真菌，往往在分别真菌的马丁培育基中参与适当的孟加拉红、链霉素和金霉素等化学药品，目的在于抑制细菌的生长，这样更有利于获得纯培育。土壤中微生物数量众多，在肥沃土壤中固氮菌数量也很多，自然界中多数氮素养料是有微生物固氮的

18、结果，固氮菌普通可分为自生固氮菌和共生固氮菌两类。要分别自生固氮菌，常用阿斯毕无氮培育基这种选择性培育基，控制其适宜的环境条件，使它在培育基上大量繁衍，然后经过稀释法或划线分别法，使它在培育基上构成单菌落，假设分别得不纯，需求进一步纯化，直到得到纯种。实验资料培育基：阿斯毕Ashby无氮培育基菜园土灭菌培育皿、镊子、剪刀、接种针、酒精灯等。方法与步骤：富集培育：第二次实验做用已灭菌后冷却至50左右的阿斯毕培育基倒平板。用已灭菌的镊子将黄豆粒大的菜园土摆入已冷凝的平板培育基上。正面放置培育箱中培育，28培育3-4天后，在土粒周围有浑浊半透明的胶状菌落出现，有的在后期会产生褐色的色素。划线分别纯化

19、：第三次实验做用已溶化至50的阿斯毕培育基倒平板；用接种环挑取上述菌落少许，在冷凝平板上进展划线分别，而后置于28培育4天。划线方法如图： HYPERLINK blog.chinahr/UploadedFiles/longfly85/EditorUploaded/20210309eda8e147-6ee9-4d7d-b729-ce938d38ef29.jpg t _blank A:交叉划线法1、2、3、4为依次划线的起点B：延续划线法1、2为依次划线的起点纯化、镜检，得到纯种培育第四次实验做1、平板上出现单菌落，按无菌操作移入阿斯毕培育基斜面试管中，28培育4天，即获得纯培育菌，可冷冻保管，备

20、用；要求每人至少保管自生固氮菌的一支斜面试管，并贴好标签。2、镜检：将斜面菌株进展涂片、染色、镜检。如是粗短杆状或球状的单一形状的菌体细胞较大，常呈单个或“8字陈列，在细胞外表有较厚的荚膜者，即为自生固氮菌。假设有杂菌，需求进一步划线纯化。本卷须知：微生物分别、纯化这一操作环节，要严厉按照无菌操作进展。平板划线时，划线部位不可重叠；划线时，每次都要将接种环上多余菌体烧掉。第四次实验：实验三 显微镜的运用详见细胞生物实验指点和细菌的简单染色法一、目的与要求：1学习微生物涂片、染色的根本技术。 2掌握细菌的简单染色法。 3初步认识细菌的形状特征，稳定学习油镜的运用方法和无菌操作技术。 二、原理：

21、细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项根本技术。微生物的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必需对它们进展染色。利用单一染料对细菌进展染色，使经染色后的菌体与背景构成明显的色差，从而能更清楚地察看到其形状和构造。此法操作简便，适用于菌体普通外形和细菌陈列的察看。 常用碱性染料进展简单染色，这是由于在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景构成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。 当细菌分解糖类产酸使培育基pH下降时

22、，细菌所带正电荷添加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。 染色前必需固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是添加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形状。 三、资料 1菌种：大肠杆菌24h营养琼脂斜面培育物，金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培育物。 2染色剂：石炭酸复红染液或草酸铵结晶紫染液。 3仪器或其他器具 显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，玻片搁架、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)，擦镜纸，生理盐水或蒸馏水等。 四、流程 涂片枯燥固定染色水洗枯燥镜检。步骤 1涂片 ：取两块干净无油的载玻片，在无菌的条件下各滴一小滴生理盐水

23、(或蒸溜水)于玻片中央，用接种环以无菌操作，分别从大肠杆菌和金黄色葡萄球菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。假设用菌悬液(或液体培育物)涂片，可用接种环挑取23环直接涂于载玻片上。留意滴生理盐水蒸馏水和取菌时不宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚。 2枯燥：室温自然枯燥。也可以将涂面朝上在酒精灯上方略微加热，使其枯燥。但切勿离火焰太近，因温度太高会破坏菌体形状。 3固定：如用加热枯燥，固定与枯燥合为一步，方法同枯燥。涂片、枯燥和热固定。 4染色：将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液12滴于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美蓝染色12min，石炭酸复红(或草酸铵结晶紫)染色约1min。

24、 5水洗： 倾去染液，用自来水从载玻片一端悄然冲洗，直至从涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要水流直接冲洗涂面。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜零落。 6枯燥：甩去玻片上的水珠自然枯燥、电吹风吹干或用吸水纸吸干均可以留意勿擦去菌体。 7镜检：涂片干后镜检。涂片必需完全枯燥后才干用油镜察看。 六 结果 ： 绘制单染色后察看到的大肠杆菌和藤黄微球菌的形状图。实验四 细菌的革兰氏染色和荚膜染色革兰氏Gram,s染色法一、实验原理革兰氏染色法是细菌学上一种重要的鉴别染色法。用这种染色法可以把细菌分为两大类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。该法所用的染料是用两种不同性质的染料草酸铵结晶紫和番红染液。细菌先

25、用草酸铵结晶紫进展初染，经碘液媒染后，再用95乙醇或丙酮乙醇脱色，最后用番红复染。如细菌坚持草酸铵结晶紫与碘复合物的颜色而不被乙醇脱色，那么细菌呈紫色，称为革兰氏阳性菌，该反响称为革兰氏阳性或正反响用G+表示；如细菌能被乙醇脱色而又能被番红染成红色的称为革兰氏阴性菌，其反响那么称为革兰氏阴性或负反响G-表示。革兰氏染色反响的机理，初染时,在细胞膜内构成草酸铵结晶紫与碘复合物, G+细胞壁厚,肽聚糖网层次多和交联致密, 95乙醇或丙酮乙醇处置时,使网孔减少,再加上它不含类脂.故乙醇处置后复合物不会溶出缝隙.反之, G-细胞壁薄,外膜层的类脂含量高, 肽聚糖网层次多和交联差,以类脂为主的外膜溶解,

26、薄而松散的肽聚糖网不能阻挠复合物的溶出.主要是由于两类细菌的细胞壁成分和构造不同，因此对结晶紫碘复合物的浸透性不同，导致了不同染色反响。芽孢杆菌和绝大多数球菌以及一切的放线菌和酵母菌都呈革兰氏阳性反响，而大多数无芽孢杆菌弧菌螺旋菌和某些球菌那么呈革兰氏阴性反响。因此，革兰氏染色法在细菌的分类鉴定和消费运用上具有重要意义。有些特殊的细菌，革兰氏染色反响不稳定，称为革兰氏不定细菌Gram variable bacteria。二、实验资料1第二周分别得到的微生物;2培育24小时的大肠杆菌E.coli，金黄色葡萄球菌;3载玻片接种环酒精灯及火柴赫克尔Hucker氏结晶紫染色液路戈Lugol氏碘液95乙醇番红染色液吸水纸显微镜。三、操作步骤一涂片1混合涂片法：取一干净载玻片，滴一小滴蒸馏水于玻片中央。按无菌操作要求，先用接种环挑取少量枯草芽孢杆菌培育物于玻片中央水滴中，涂布均匀。接种环经灼烧灭菌冷却后，再挑取少量大肠杆菌培育物，混涂于玻片中央枯草芽孢杆菌菌液中，制成混合涂片。要求涂片薄而均匀。2三区涂片法：在一干净载玻片近两端各滴一小滴蒸馏水，按无菌操作要求，先用接种环取少量枯草