病毒性肝炎血清学检测基础和实践

1、关于病毒性肝炎血清学检测的基础与实践第一张，PPT共六十八页，创作于2022年6月为什么ELISA检测抗体容易假阳性?抗体的粘附特性，特别是IgM抗体ELISA的高灵敏性抗体结合抗原的适应性： FabCDR抗-HIV 初筛试验抗-HIV 确诊试验第二张，PPT共六十八页，创作于2022年6月CLVLVHCH1CH2CH3V区Fab段Fc段s-ss-ss-ss-sCDR1CDR3CDR2抗体结构简图IgM是五聚体，与抗原具有5或10价结合力。Fab：fragment antigen-binding CDR：complementarity determining region Fab段抗体结合抗原

2、的适应性： FabCDR第三张，PPT共六十八页，创作于2022年6月抗体产生过程简图第四张，PPT共六十八页，创作于2022年6月间接ELISA检测抗体1. 抗原包被2. 封闭3. 待测血清4. 酶标二抗5. TMB显色6. 2M H2SO47. OD450EEEEEE+ Substrate TMB抗-IgG抗-IgA抗-IgMIgGIgAIgM第五张，PPT共六十八页，创作于2022年6月抗体的粘附特性00.501.001.502.00原倍10100100010000血清稀释倍数OD450间接ELISA，无抗原包被间接法ELISA检测抗体，灵敏，但容易出现假阳性第六张，PPT共六十八页，创

3、作于2022年6月捕捉法ELISA检测IgM抗体1. 抗mu链抗体包被2. 封闭3. 待测血清4. 酶标抗原（特异性）5. TMB显色6. 2M H2SO47. OD450CLVLVHCH1CH2CH3V区s-ss-ss-ss-s敏感性较间接法低，但特异性强第七张，PPT共六十八页，创作于2022年6月ELISA检测抗原1. 抗体包被2. 封闭3. 待测血清4. 酶标抗体5. TMB显色6. 2M H2SO47. OD450EEEEEE+ Substrate TMB包被抗体与酶标抗体识别的免疫表位必须不同第八张，PPT共六十八页，创作于2022年6月病毒性肝炎甲型乙型丙型丁型戊型Hepatit

4、is A Virus, HAVHepatitis B Virus, HBVHepatitis C Virus, HCVHepatitis D Virus, HDVHepatitis E Virus, HEV消化道血液消化道感染途径血液血液病原学病程分型急性急性, 慢性急性, 慢性急性, 慢性急性GBV-C，所谓庚型肝炎病毒，不引起肝损，不是肝炎病毒EB病毒、巨细胞病毒等可引起肝损，但以脏器损伤为主，不称肝炎病毒第九张，PPT共六十八页，创作于2022年6月病毒性肝炎的病原诊断根据临床表现无法确定病原诊断依赖实验室检查血清学方法：血清+免疫技术检测抗原或抗体分子生物学：酶免疫测定：enzyme

5、immunoassay, EIA酶联免疫吸附测定：enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA 分子杂交：同位素或其他物质标记已知DNA或cDNA，即探针，与待测标本中的核酸互补，特异性结合。淘汰聚合酶链反应：polymerase chain reaction，PCR普遍使用第十张，PPT共六十八页，创作于2022年6月甲型肝炎病毒 HAV无包膜RNA病毒：抗原种类少正链RNA，7.4 kbHAV抗原只有一种，即衣壳蛋白；难以测到，不开展特异性抗体：抗-HAV IgG, IgM ，保护性抗体；常用HAV RNA：RT-PCR检测，但阳性率低，仅用于研究第十一

6、张，PPT共六十八页，创作于2022年6月024681012 抗甲肝抗体浓度感染后周数病毒血症大便排病毒转氨酶升高期症状期IgMIgGHAV感染后人体抗体应答抗-HAV IgM：感染后3周即可阳性，1-3月后转阴，近期或急性感染。抗-HAV IgG：IgM产生后数天即可阳性，存在数十年，单纯阳性很可能是既往感染，故单独检测抗-HAV IgG通常不用于诊断。第十二张，PPT共六十八页，创作于2022年6月甲型肝炎诊断流程同时检测抗HAV IgM和IgG时：4种情况仅检测抗-HAV IgM时甲型肝炎抗-HAV IgM 阳性抗-HAV IgG 阳性甲型肝炎1. 2. 既往感染，对甲肝有免疫力排除甲肝

7、，而且为易感者抗-HAV IgM 阴性抗-HAV IgG 阳性抗-HAV IgM 阴性抗-HAV IgG 阴性3. 阳性阴性排除第十三张，PPT共六十八页，创作于2022年6月甲型肝炎诊断流程同时检测抗HAV IgM和IgG时：4种情况甲型肝炎早期或IgM假阳性1-2周后复查甲型肝炎甲型肝炎IgM 假阳性排除甲型肝炎抗-HAV IgM 阳性抗-HAV IgG 阴性IgM 阳性IgG 阳性IgM 阴性IgG 阳性IgM 阳性IgG 阴性4. 第十四张，PPT共六十八页，创作于2022年6月乙型肝炎病毒 HBV颗粒完整HBV： Dane particle；球形，42 nm，双层壳膜结构 小球形颗粒

8、：22 nm，乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen, HBsAg）丝状(管状)颗粒：直径22 nm，长短不等，HBsAg18.7万倍20万倍25万倍HBV双层壳膜结构，外层是HBsAg，内层是HBcAg第十五张，PPT共六十八页，创作于2022年6月HBV基因与基因产物pre-S1pre-S2ORF SORF PORF XORF Cpre-C+-55HBsAgPolymerase:DNA polymeraseRNase HReverse transcriptaseothers HBxAgHBcAgHBeAgpre-S1pre-S2第十六张，PPT共六十八页，创作

9、于2022年6月HBV主要结构示意图HBsAgHBcAgHBV DNAHBeAg不是病毒的结构成份第十七张，PPT共六十八页，创作于2022年6月HBV PreC/C基因序列1814 atgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcttgtt catgtcctac 1861 tgttcaagcc tccaagctgt gccttggggg gctttgggac atggacattg 1911 accactataa agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct 1961 tttgacttct ttccttctat tcgagatct

10、c ctcgacaccg cctctgctct2011 ctatcgagag gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct caccatacag 2061 cactcaggca agctgttctg tgttggggtg agttgatgaa tctggccacc 2111 tgggtgggaa gtaatttgga agacccagca tccagggaat tagtagtcgg2161 ctatgtcaat gttaatatgg gcctaaaaat cagacaacta ttggggtttc 2211 acatttcctg tcttactttt ggaagagaaa

11、ctgttctaga gtatttggtg 2261 tcttttggag tgtggattcg cactcctccc gcttacagac caccaaatgc 2311 ccctatctta tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgaggca2361 ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag gtctcaatcg 2411 ccgcgtcgca gaagatctaa atctcgggaa tctcaatgtt ag第十八张，PPT共六十八页，创作于2022年6月MQLFHLCLII SCSCPTVQAS KL

12、CLGGLWDM DIDHYKEFGA SVELLSFLPF DFFPSIRDLL DTASALYREA LESPEHCSPH HTALRQAVLC WGELMNLATW VGSNLEDPAS RELVVGYVNV NMGLKIRQLL GFHISCLTFG RETVLEYLVS FGVWIRTPPA YRPPNAPILS TLPETTVVRR RGRSPRRRTP SPRRRRSQSP RRRRSKSRES QC 147-149HBV Pre C/C 编码 HBcAg/HBeAgHBcAg: 21.5 kDHBeAg: 15.5 kD第十九张，PPT共六十八页，创作于2022年6月HBV抗原

13、535342 nmHBsAgHBcAgHBV DNAHBeAg不是HBV本身的成分是HBcAg的裂解产物能释放到细胞外外周血能测到能释放到细胞外外周血能测到不能释放到细胞外外周血不能测到外周血无游离HBV DNA检测时先裂解HBVHBV示意图第二十张，PPT共六十八页，创作于2022年6月HBV抗原535342 nmHBsAgHBcAgHBV DNAHBeAg不是HBV本身的成分是HBcAg的裂解产物能释放到细胞外外周血能测到能释放到细胞外外周血能测到不能释放到细胞外外周血不能测到外周血无游离HBV DNA检测时先裂解HBVHBV示意图第二十一张，PPT共六十八页，创作于2022年6月HBV携

14、带者肝脏每天释放101012病毒血液HBsAg是HBV的1000100000倍HBV编码抗原特点第二十二张，PPT共六十八页，创作于2022年6月HBsAg抗-HBsHBsAg+，有传染性HBsAg+ 和HBeAg+，传染性强HBsAg -，无传染性，除隐匿性感染或变异外抗-HBs+，10 mIU/ml，有保护力HBeAg抗-HBe抗-HBc乙型肝炎病原学检测HBV DNA有条件的开展抗病毒治疗考核疗效第二十三张，PPT共六十八页，创作于2022年6月乙肝血清学检测结果的意义HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc临床意义+-+-+感染、传染性强+-+感染、有传染性+-+-感染、有传

15、染性+-+感染、有传染性+-+-感染、传染性强+/-+/-+/-感染、有传染性、病毒可能变异+-感染潜伏期、有传染性+-接种疫苗后、无传染性第二十四张，PPT共六十八页，创作于2022年6月HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc临床意义-+-+既往感染已恢复、有保护力-+-+既往感染已恢复、有保护力-+-+-既往感染已恢复、有保护力-+-接种疫苗或既往感染已恢复、有保护力-+既往感染已恢复、无保护力-+-既往感染已恢复、无保护力-+既往感染已恢复、无保护力-既往无感染、易感人群乙肝血清学检测结果的意义第二十五张，PPT共六十八页，创作于2022年6月为什么可通过检测外周血抗原诊断H

16、BV感染？HBeAg能释放到细胞外比较容易测到HBsAg能释放到细胞外可测到HBV携带者肝脏每天释放101012病毒血液HBsAg是HBV的1000100000倍其他病毒复制过程中，缺乏类似特性，不释放游离抗原，故通常不检测抗原，而通过检测特异性抗体而诊断。以上原因，决定了诊断HBV感染可通过检测病毒抗原。容易测到第二十六张，PPT共六十八页，创作于2022年6月抗-HBc的意义抗-HBc IgG：长期存在，阳性时如HBsAg阴性，既往感染抗-HBc IgM：短期存在，阳性时，通常HBsAg也阳性；见于急性感染或慢性携带者急性发作实际工作中，抗-HBc阳性具有传染性 基本不正确抗-HBc Ig

17、M具有传染性正确目前检测的抗-HBc是总抗体，包括IgG、IgM等，只要IgG阳性，抗-HBc即阳性；多数情况下，抗-HBc阳性仅是 IgG抗体阳性。正确HBsAg阳性具有传染性第二十七张，PPT共六十八页，创作于2022年6月HBsAg()HBeAg(+)阳性HBV携带者March 2008October 2008January 2009HBsAg (IU/ml)- (0.01)- (0.00)抗-HBs (mIU/ml)+ (5356)+ (11578) HBeAg + (72.78)+ (72.89)抗-HBe- (4.33)- (4.28)抗-HBc+ (11.89)+ (15.91)

18、抗-HBc IgMnot done-ALT (U/L)21.024.221.5HBV DNA (copies/ml)not done+ (491)+ (370)第二十八张，PPT共六十八页，创作于2022年6月HBsAg()HBeAg(+)阳性携带者新的S基因变异PCR产物测序克隆后测序第二十九张，PPT共六十八页，创作于2022年6月pre S2 geneHBsAg()HBeAg(+)阳性携带者前S2基因序列PCR产物测序克隆后测序第三十张，PPT共六十八页，创作于2022年6月HBsAg()HBeAg(+)阳性HBV携带者IF 3.124第三十一张，PPT共六十八页，创作于2022年6月具

19、有研究价值的HBV标本HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc研究内容+/-+/-+/-变异+-转归+-+-转归+-+-？抗c阴性-+-+-？抗c阴性-+-？抗c阴性*-+-？抗c阴性*未接种疫苗，即自然感染除外。第三十二张，PPT共六十八页，创作于2022年6月丙型肝炎病毒 HCVHCV 30-60 nm有包膜的RNA病毒，核心含有核心蛋白和RNA单链正义HBVHCV抵抗力弱，且RNA容易降解，检测核酸时，标本需在30分钟内分离血清，-80 C保存。第三十三张，PPT共六十八页，创作于2022年6月Lipid layer脂质层Core, 核心蛋白E1, 包膜蛋白1E2, 包膜蛋白2

20、RNA, 病毒核酸直径30-60 nm结构蛋白HCV结构简图糖基化蛋白HCV示意图第三十四张，PPT共六十八页，创作于2022年6月HCV基因与基因产物hypervariable region 1, HVR1Untranslated Region, UTR Noncoding region, NCR 针对HCV所有抗原的抗体都没有证实有中和作用第三十五张，PPT共六十八页，创作于2022年6月HVR138 clones15 sequencesHCV高度变异HVR1第三十六张，PPT共六十八页，创作于2022年6月抗原检测 HCV core: 仅用于研究抗-HCV IgM：一般不开展，阳性率低H

21、CV RNA：有条件的开展；抗病毒治疗考核疗效抗-HCV IgG：开展，(+)通常表示有HCV感染HCV病原学诊断针对HCV所有抗原的抗体都没有证实有中和作用第三十七张，PPT共六十八页，创作于2022年6月抗-HCV IgM：一般不开展抗-HCV IgG：开展，90-95的(+)提示HCV感染HCV病原学诊断抗-HCV检测包被抗原1st代3rd代2nd代50-75%90-95%95-99%阳性率第三十八张，PPT共六十八页，创作于2022年6月丁型肝炎病毒 HDVDeltavirus genus中的唯一病毒HDV, 36 nmHDV RNA, 1.7 kb缺陷病毒，必须有HBsAg第三十九张

22、，PPT共六十八页，创作于2022年6月HDAg：仅用于研究抗-HD IgM：()近期感染抗-HD IgG：()感染HDV RNA：仅用于研究HDV病原学检测仅在HBsAg阳性人群中检测才有意义：第四十张，PPT共六十八页，创作于2022年6月戊型肝炎病毒 HEV属于family Hepeviridae, genus HepevirusHEV, 30-32 nm无包膜：抗原种类少新的HEV发现：兔HEV王佑春等第四十一张，PPT共六十八页，创作于2022年6月HEV基因及其蛋白ORF1ORF3 ？ORF253核衣壳Capsid非结构蛋白结构蛋白主要抗原决定簇中和免疫459607核酸：单链正义R

23、NA，7.2 kb第四十二张，PPT共六十八页，创作于2022年6月02468101214转氨酶升高期症状期IgMIgG病毒血症大便排病毒 抗戊肝抗体浓度感染后周数HEV感染后人体抗体应答与HAV类似抗-HEV IgM：感染后3周即可阳性，1-3月后转阴，近期或急性感染。抗-HEV IgG：IgM产生后数天即可阳性，存在数十年，单纯阳性很可能是既往感染，故单独检测抗-HAV IgG通常不用于诊断。第四十三张，PPT共六十八页，创作于2022年6月HEV抗原：一般不开展，仅用于研究HEV病原学检测与甲肝类似抗-HEV IgM：()近期感染抗-HEV IgG：双份血清HEV RNA：一般不开展，仅

24、用于研究第四十四张，PPT共六十八页，创作于2022年6月HEV病原诊断抗-HEV同时检测抗HAV IgM和IgG时：4种情况仅检测抗-HEV IgM时戊型肝炎抗-HEV IgM 阳性抗-HEV IgG 阳性戊型肝炎1. 2. 既往感染，对戊肝有免疫力排除戊肝，而且为易感者抗-HEV IgM 阴性抗-HEV IgG 阳性抗-HEV IgM 阴性抗-HEV IgG 阴性3. 阳性阴性排除第四十五张，PPT共六十八页，创作于2022年6月同时检测抗HAV IgM和IgG时：4种情况戊型肝炎早期或IgM假阳性1-2周后复查戊型肝炎戊型肝炎IgM 假阳性排除戊型肝炎抗-HEV IgM 阳性抗-HEV

25、IgG 阴性IgM 阳性IgG 阳性IgM 阴性IgG 阳性IgM 阳性IgG 阴性4. HEV病原诊断抗-HEV第四十六张，PPT共六十八页，创作于2022年6月抗-HEV检测试剂质量差异很大(国外)方法种类抗原ORF来源病毒+血6月20例-血清22例1EIAR2昆虫巴基91802EIAR2昆虫缅甸92003WBR2昆虫缅甸9201 64WBR2,3大肠中国8190 15EIAR2大肠缅甸 91906EIAR2,3大肠缅,墨51407EIAR2,3大肠缅,墨91708EIAR2,3大肠缅,墨614 109EIAS3缅甸115 210EIAS2缅甸7 13 6011EIAS3缅,墨22012E

26、IAS2,3缅,墨6100Hepatology 1998;27:857-861.第四十七张，PPT共六十八页，创作于2022年6月12种检测方法早期康复期血清抗-HEV滴度Hepatology 1998;27:857-861.WBWB昆虫大肠杆菌合成肽第四十八张，PPT共六十八页，创作于2022年6月抗-HEV IgG诊断试剂阳性率比较(国内外)厂商结果明确人群 (符合率%)总符合率%230例普通人群 (%)患者24例非患者30例万泰+23 (95.83)1 (3.33)96.3073 (31.74)-1 (4.17)29 (96.67)高达+21 (87.50)094.4440 (17.39

27、)-3 (12.50)30 (100)华美+21 (87.50)1 (3.33)92.5955 (23.91)-3 (12.5)29 (96.67)GeneLab+16 (66.67)085.1818 (7.83)-8 (33.33)30 (100)科华+11 (45.83)075.938 (3.48)-13 (54.17)30 (100)不同试剂检测结果偏差很大，尤其在血清流行病学调查。中华实验和临床病毒学杂志 2007;21(1):59-61.第四十九张，PPT共六十八页，创作于2022年6月抗-HEV IgM抗-HEV IgG检测方法存在一定假阳性和假阴性第五十张，PPT共六十八页，创作

28、于2022年6月607-660ORF21-111458-607ORF3-EORF3-S112391123ORF36601主要抗原决定簇GeneLabs 试剂的抗原，间接法J Virol Methods 1992;38(1):17586.包被抗原ORF2ORF31和2型、合成肽和细菌表达灵敏度和特异性低第五十一张，PPT共六十八页，创作于2022年6月ORF2衣壳蛋白，72 kDa国产抗-HEV试剂盒所用抗原万泰公司抗原：IgM，包被mu链，酶标抗原IgG，包被抗原，酶标二抗3946061660 特异性高灵敏度较高458-607高达试剂：合成肽？同时包括了ORF2 和ORF3多肽抗原，具体不详？

29、首都公共卫生2007;1(4):168-170.华美公司和科华公司：第五十二张，PPT共六十八页，创作于2022年6月灵长动物实验感染后 抗-HEV IgM和IgG应答Yu, et al. CGLI 2003第五十三张，PPT共六十八页，创作于2022年6月急性戊肝病人抗-HEV IgM和IgG应答Seriwatana, et al. CGLI 2002第五十四张，PPT共六十八页，创作于2022年6月如何提高戊型肝炎诊断的准确性？急性HEV感染，发病时抗-HEV IgM 和 IgG 通常同时阳性确诊同时检测抗-HEV IgG和IgMIgGIgMIgGIgMIgGIgMIgGIgM12周后复查

30、排除既往感染IgGIgMIgGIgMIgGIgM确诊假阳性假阳性第五十五张，PPT共六十八页，创作于2022年6月Ch1374 (Sar-55, I)A450Ch1375 (Sar-55, 1)458-6071660112-6070.00.53.03.50246810131517112-607458-607475-607475-607Ch1374 (Sar-55, 1)感染后周数感染后周数0.00.51.01.52.02.53.03.50246810131517112-607458-607475-607A4501.01.52.02.5利用抗原主要决定簇多肽的高反应性检测阳性标本利用抗原主要决定

31、簇截短肽的无反应性排除假阳性如何提高戊型肝炎诊断的准确性？第五十六张，PPT共六十八页，创作于2022年6月表达载体HEV ORF21660459459607594ORF2 多肽的蛋白表达472607将重组质粒导入大肠杆菌第五十七张，PPT共六十八页，创作于2022年6月1 2 3 1 2 3 1 2 3 459-607 459-594 472-607kDa362216ORF2多肽大肠杆菌表达ORF2多肽SDS电泳结果第五十八张，PPT共六十八页，创作于2022年6月459-607459-594472-607459-607459-594472-607kDa36221650二聚体单体SDS加样缓

32、冲液煮沸 5 min不加热ORF2多肽的二聚体特性SDS电泳结果第五十九张，PPT共六十八页，创作于2022年6月3622二聚体单体抗-His6抗-HEV抗-HEV459-607459-594472-607459-607459-594472-607459-607459-594472-607抗-HEV仅与ORF2多肽二聚体反应1660459459607594472607+-kDaWestern blotting 蛋白免疫印迹结果ORF2第六十张，PPT共六十八页，创作于2022年6月点突变对459-607多肽二聚体的影响595562580476二聚体单体SDSWestern blotting突变

33、ORF2多肽无突变无突变595562580476突变ORF2多肽及其抗体反应性变化从不同角度证实抗-HEV仅与二聚体反应第六十一张，PPT共六十八页，创作于2022年6月0.000.501.001.502.002.50E10E15E29E31E32E34E57E83E100E101E102E110E127E130E136E153样 本OD450459-607多肽472-607多肽抗-HEV IgM阳性血清仅与459-607多肽反应，几乎不与472-607多肽反应 (ELISA检测结果)第六十二张，PPT共六十八页，创作于2022年6月SerumGenelabs 本室 OD450ALT OD450Result459-607472-