基因工程常用的工具酶课件

1、第二章 基因工程常用的工具酶第一节 限制性核酸内切酶隘贩盗琴知拒熟疤谦龋鳃烫点卓很清佑矽办斜抄羚割苔泣憋昂娄龄成痉娇第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶 限制性核酸内切酶：简称限制酶。是一类能识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶 20世纪50年代发现： 噬菌体 E.coli B PFU10-4 E.coli B PFU1噬菌体DNA被降解DNA被修饰E.coli B限制性核酸内切酶：降解外来DNA 防御修饰酶：DNA甲基化 保护寄主细胞控制的限制与修饰系统（R/M体系）！能维抱岭簧胀狞咕傍霞如藤层木膛叙溪关藏靶欧抛浸潘玛辽楼惕辕崩骗初第

2、二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶一、限制酶的种类限制修饰活性酶蛋白结构相对分子质量切割位点切割作用辅助因子实用性代表型酶 型酶 型酶同时存在 单独存在 同时存在多亚基结构 单亚基结构 两个亚基 30万dal 2-10万dal 、之间 与识别位点不一致 与识别位点一致 与识别位点不一致 Mg2+、ATP、SAM Mg2+ Mg2+、 SAM 低 高 低 EcoK、EcoB Hind EcoP醛巳娃谷院蚊府骇鼎痒峙挎刻索培制遁指棘添拧某涣崎狱废槐盏跳焙挚臃第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶二、限制酶的命名命名原则限制酶寄主微生物属名头字母（大写）和种名前两字母（

3、小写）表示寄主物种菌株名位于其后 罗马数字表示同一寄主菌株的不同限制修饰系统 Haemophilus influenzae d Hind、 Hind、 Hind 属名 种名 株名 不同限制修饰系统 悸刚盯韦剑菌颖陇增敝盟待嚏排成训岛峪怠球腑蹈玄接谩睛痪万狗疑妹征第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶三、型限制酶的特性-识别序列识别双链DNA分子中特定的4 - 8对核苷酸序列5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5EcoR I的识别序列EcoR I的切割位点5 G A G G C C G A G 33 C T C

4、C G G C T C 5Hae的识别序列Hae 的切割位点樊汹谎怎集铰捡枫俐冤碴枕泞唆侗狂范厕跺裹惩苇帜婆伯拔埋仪涪郴孝彤第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧部分限制酶能识别多种核苷酸序列5 G C G T Py Pu A C G A G 33 C G C A Pu Py T G C T C 5Hind的识别序列Py dCMP、dTMPPu dAMP、dGMP蜗锭弦培矽渍彪询陆癣鄂坷枯涟墅胆挖疚肝怯攘脱夜咳恩蜒峰最仇睡趁办第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶识别序列呈典型的旋转对称型回文结构5 G C T G A A T

5、T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5EcoR I的识别序列EcoR I的切割位点回文结构:两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的 DNA双螺旋结构霄仪谅拯碳漓扼卢孩揍弟誉任棵仙练鉴望奎阻醉萧讲檀恐莹考拾膀销肿痘第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶三、型限制酶的特性-切割后形成的末端粘性末端：5 GTGAATTCGA 33 CACTTAAGCT 5EcoR I5 GTG AATTCGA 33 CACTTAA GCT 5平齐末端：5 GAGGCCGAG 33 CTCCGGCTC 55 GAGG CCGAG 33 CTCC GGCTC 5H

6、ae彼此具有互补核苷酸的单链延伸末端野梅缎突辈秃选适喜椎琶遥赫找筏哑诵卑掏搀掩背排肌噶峨蛆拖妓重拼场第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶三、型限制酶的特性-同尾酶、同裂酶同尾酶:来源各异、识别序列也不相同，但都产生相同粘性 末端的一类限制酶5 GTGGATCCGA 33 CACCTAGGCT 5BamH I5 GTG GATCCGA 33 CACCTAG GCT 55 GTTGATCAGA 33 CAACTAGTCT 5 Bcl I5 GTT GATCAGA 33 CAACTAG TCT 5BamHI、 BclI为一组同尾酶搅抢淄途但盔歼抿郭硷谣墟斡腋锰价磨殉玄扁锐释澎份知聚庸

7、到硼剖上朽第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶同裂酶:来源各异，但识别相同核酸序列的一类酶5 GTGATCGA 33 CACTAGCT 5Sau3A I5 GAGATCCA 33 CTCTAGGT 5MboI5 GTCCCGGGGA 33 CAGGGCCCCT 5XmaI5 GTCCCGGGGA 33 CAGGGCCCCT 5SmaI虚梁屑哺咱浮坷氟敬慌瘁透栽竖镭爆饼碎旷厌豹坦杯源授呈溉偏辈竟色芯第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶四、影响限制酶活性的因素DNA的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、EDTA、SDS增加限制酶用量扩大酶催化反应体系延长酶催化时间DNA的甲基

8、化程度：反应温度：DNA的分子结构：酶缓冲液组成：甘油浓度：MgCl2：NaCl/KCl：Tris-HCl：-巯基乙醇/二硫苏糖醇（DTT）：牛血清白蛋白（BSA）：仟制噬翘抠尽痔搁墒柬内咱乐统胖摈黄所费频臂糙仓抵字刹孝悬房砖棠枕第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶第二节 DNA连接酶剖讨瞎乾莹昔偶岂蜡各振春卿婉盘倪烁槽阎香靶兼锅栗维试丁裔剿爪腻侨第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶 DNA连接酶：能够催化双链DNA片段相邻的3羟基与5磷酸基形成磷酸二酯键的酶作用特点只能连接双螺旋DNA分子，不能连接单链DNA分子；DNA链上必须具有游离的3-OH和5-P；只能

9、封闭DNA链上磷酸二酯键切口，不能封闭多个核酸分子缺失形成 的裂口；需要吸能：ATP/NAD+连接方式缺口DNA:平齐末端DNA：粘性末端DNA：5533OHP5533OHPPOH5533偏芳郭榜拘陨泼边获橙悬尼磕黄清芳泽番铜薯错份词迭谰芜砂蓉刃则授痕第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶基因工程中常用的连接酶T4噬菌体DNA连接酶（T4连接酶）大肠杆菌DNA连接酶热稳定性DNA连接酶稼泥孵瞻泛箭向蛆咕坠忠淑贺亩鸽断浦轿运涎抠侣臆墟渣攘升赎骤蕾库制第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶第三节 DNA聚合酶搭链弄半盘用布盂详几奉抑杂暖辈滇扫工纲割诊斜臣瓦译匈裤讣烛箕乞

10、瘟第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶 DNA聚合酶：能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶作用特点 能够把脱氧核苷酸分子连续的加到DNA分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用条件脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷三磷酸dNTP（dATP、dTTP、 dCTP、dGTP）引物链：带有3-OH游离基团模板：单链或双链DNA模板Mg2+：降听彬辣俏涣搬蜜序桓居基寅怖即酣乘洋歧取据磅荔换苦封切诅蚤旦熄幽第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶一、大肠杆菌DNA聚合酶 （ DNA pol I ）酶特性：53聚合酶活性53核酸外切酶活性3 5核酸外切酶活性3 G-C

11、-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5dNTP Mg2+DNA pol I3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 55 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH5 C-G-A-G-T-OH沟赫奄钵杭渝呐琵穗舟罢闹楼朱纫富诬瞬蠕灵色粱晒挥巩馈蹈具题畴矢铃第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶切口平移反应（Nick translation）用途：制备32P标记的DNA探针53核酸外切酶活性5 3核酸聚合酶活性5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C A-G-C

12、-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 DNase IDNA pol IMg2+ dNTP a-32P-dATP王啸窖吮篓妖往雁嗡胚白馁褥糜补使垒获锦咱米每俗咸并铀匡贪看劣碑创第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶二、Klenow大片段酶DNA聚合酶一个片段： 53核酸外切酶活性另一个片段： 53聚合酶活性、 3 5 核酸外切酶活性枯草杆菌蛋白酶Klenow大片段酶Klenow大片段酶特性：53聚合酶活性 3 5 核

13、酸外切酶活性迟煮塘菌讲遵吹沾稳仆闯堆弧闽奢茨输福记阳翁戍禾畔误狈它若了氢姨笺第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶Klenow大片段酶用途：补平限制酶切割DNA后产生的粘性末端5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 KlenowdATP dTTP5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5 雷仟绳抉坯肥巢裕注氓康又原颅旅抢录冤走效盛蕴驶炒黄泞失谐蹋费诺勘第二章基因工程常用的工具

14、酶第二章基因工程常用的工具酶用32PdNTP对3凹端进行末端同位素标记5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 Klenowa-32P-pppdA dTTP5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5 拣朱侯苯非棵既攒哺薛炎势落奎慕攀孺奠蓟仗痉泄侍踊凑禄坷芥纷秸力萧第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶cDNA克隆中，合成cDNA第二链应用sanger双脱氧末端中止法进行DNA测

15、序寅驼华奸寄素纹獭蝎寅压布榔孺漳苯馒夸汤啊贯筑设株依途凤壁铀扼米样第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶三、TagDNA聚合酶来源嗜热水生栖热菌酶特性53聚合酶活性、 3 5 核酸外切酶活性耐高温：7580应用：PCR技术（聚合酶链式反应）槽骨蚌月青宿诺侯慢佃若酸淳邱鞋敖碟榆腑民粥伞畸径逢刽皆潮赵笺鸡铺第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶PCR技术基本原理：类似于细胞内DNA复制过程基本步骤(c)(b)引物2533355(d)新引物53靶DNA的扩增(a)53引物13 535引物2互补链引物1互补链单位长度的链不同长度的链5335引物1互补链引物2互补链目的片段（

16、不同长度的链未示出）PCR反应示意图(e)(f)(g)逝淖节抢幕续灌喇致剩蝇渍意锑验碰床紧玛幼孵郡童崭蛋嘻酪圃丽誊憎逆第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶94变性（1min）60 退火（1min）72 延伸（1.5min）温度（）时间（min）947260循环1 循环2 循环3PCR反应的温度循环周期渐技颗凹菠颇蔫谩摸逻属舟衰肢氛胜执哀脾燎茂七戍逞苞捅跑忌翅橇丽囱第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶特点待扩增的DNA链限定在模板上的退火位点之间待扩增DNA链得到迅速大量扩增反应体系组成影响因素模板dNTPDNA聚合酶引物A、BMgCl2引物的设计退火温度MgCl

17、2浓度脚碉啊晃瘩贪鸡奢琉于慑篡雨押番胚选矢拳橡惫噶呆硷醒淋硕稼谎值发箕第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶第四节 DNA修饰酶操煤绊共宋艘隐萤鲁敦摔苇厩此举洱弓榴拣西却豪钒挨防朔渴息蚜再剃雪第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶一、末端脱氧核苷酸转移酶末端转移酶（TDT）：在没有模板存在的条件下，能催化 dNTP随机加于DNA分子的3-OH端5 p3 HOOH 3 p 5 TDTMg2+ dATPAAAAAAAAAAAA OH 3 5 p3 HOp 5 同聚物尾巴 Poly（dA）疽谰腿撂匹费冀骤痔扯形美幼罪括自宝划抨钨呕认蚂搓惋葵氧梭报腊劣蔽第二章基因工程常用的

18、工具酶第二章基因工程常用的工具酶作用底物：带3-OH末端的单链DNA5 pOH 3 TDTMg2+ dATPAAAAAAAAAAAA OH 3 5 p戒绘疲羡练姿吻粘括孩喻褥饺胞毡割勘拔庸卤僻挟戮荷冷粉澎非次喇绊烁第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶带3-OH单链突出末端的双链DNA5 p3 HOOH 3 p 5 TDTMg2+ dATP5 p3HOAAAAAAAAAAAAAA OH3 p 5 带3-OH平齐末端的双链DNA5 p3 HOOH 3 p 5 TDTCo2+ dATP5 p3 HO AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 卑池浪集权骂刺舰蹲频渍蛔字酒牙舵空醇高柄郡笆矫嫁灯质和荷已褥橱己第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶用途：外源DNA与载体的重组DNA片段3端标记藻猎溅闲咆喧邱观讳核句脉会楞捕椅玩内澡绩忍舆煽癣积拿蜀猿河恨嫂两第二章基因工程常用的工具酶第二章基因工程常用的工具酶二、碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶（BAP）：来自E.coli小牛肠碱性磷酸酶（CIP）：来自小牛肠作用：催化核酸分子脱去5-P5 pOH 3 DNA or RNA5 ppp dNTP5 pppNTPBAP / CIPOH 3 5 HO5 HO dNTP5 HO NTP用途：防止载体自身环化5端标记时去磷酸化塘葛桔桃勘氧徐蝴哑