蛋白纯化及抗体制备方法

1、蛋白表达及抗体制备流程图构建蛋白原核表 达载体（带HISor GST接头）重组质粒转入蛋 白表达菌株BL21 or ER2566转化菌株的小量诱导表达转化菌株的大量诱导表达抗体的制备抗血清的检 测具体实验步骤蛋白原核表达载体的构建蛋白原核表达载体一般带有His or GST接头。构建载体时要确保读码框 的正确。重组质粒转入蛋白表达菌株BL21 or ER2566转化方法同常规转化。转化菌株的小量诱导表达从转化的平板中挑取单菌落，接种于2mL含Amp的LB液体培养基中，37C 振荡培养过夜；取100U l过夜培养的菌液接种于2mL含Amp的LB液体培养基中，37C振 荡培养50min左右，使OD

2、600达到06-08；加入IPTG至0.5mM, 37C诱导培养4鱼；(注意设置不加IPTG的对照；一 般诱导条件为37C诱导培养4 h,但根据蛋白的不同，诱导温度和时间会有 所不同)；取1mL菌液，12000rpm离心10min，收集菌体；用100 L PBS悬浮菌体菌体，加入20 L 6XSDS凝胶加样缓冲液，100C 沸水浴10 min ；12000rpm离心10 min，取菌体裂解液上清进行SDS。(if经诱导的菌株有目的蛋白表达，则继续如下操作)以相同条件诱导并收集菌体(方法见1-4)；加入200U L PBS悬浮菌体；将浑浊的菌体悬浮液超声至变清(注意冰上操作)；12000rpm离

3、心10min，取上清至另一干净EP管，即为上清管余下沉淀用100 L PBS悬浮，即为沉淀管(包涵体);分别向上清管和沉淀管中加入6XSDS凝胶加样缓冲液，100C沸水浴10 min；12000rpm离心10 min，取上清管和沉淀管的上清进行SDS。(if蛋白在上清或沉淀中有特异表达，则继续进行大量诱导表达)转化菌株的大量诱导表达挑取单菌落于5 mL含Amp的LB液体培养基中，37C振荡培养过夜；按1： 1000的比例转接扩大培养，37C振荡培养至0D60(ji 0.6-1.5左右(一 般250mLLB中加入5mL菌液，培养1h50min左右；最好摇500mL，以便有足 够的样品做后续实验)

4、加入IPTG至0.5 mM,37 C诱导4h (一般诱导条件同小量诱导；但根据蛋 白不同，有的诱导条件会有所不同。一般降低诱导温度，减少蛋白表达量可 能使蛋白在上清中表达；但大部分的蛋白是在包涵体中表达);取1mL菌液，12000rmp离心10min；进行(三)(8) - (13)的操作；western blot检测特异表达蛋白是否为目的蛋白;if蛋白在上清中特异表达，则用珠子吸附纯化上清(方法见试剂盒说明书)；if蛋白在包涵体中特异表达，则洗涤包涵体(方法见步骤五)。包涵体的洗涤纯化8500rpm离心10min，收集沉淀；1000mL的菌液离得的沉淀用50mL的裂解液吹起，超声波破碎细胞；4

5、C，8000g，离心 10min，包涵体沉淀以 50mL 2% 的 Triton X-100/BufferI重悬，37C恒温振荡30 min；4C， 8000g，离心10min，沉淀以50mL的BufferI重悬，超声波处理 5min/100mL 悬浮液；4C，8000g，离心 10min，包涵体沉淀以 50mL 2%的 Triton X-100/Buffer I 重悬，37C恒温振荡30 min；4C，8000g，离心10 min，沉淀以50mL的Buffer I重悬，37C恒温振荡 30 min。4C，8000g，离心 10 min，沉淀以 50mL 的 2 mol/L 尿素/Buffer

6、 I 溶解， 室温搅拌30min；4C，8000g，离心10min，沉淀以50mL或25mL (根据蛋白量决定)的4mol/L 尿素/BufferI溶解，室温搅拌30min；4C，8000g，离心10min，沉淀以50mL或25mL (根据蛋白量决定)的8mol/L尿素/BufferI溶解，室温搅拌30min。(注：保留各个步骤的上清或溶液进行SDS； 溶解蛋白的尿素量不宜过多；蛋白浓度差异不大的条件下，优先选择低浓 度的尿素样品溶液作为免疫抗原。整个过程在冰上进行）（六）蛋白复性透析复性法：将适量的含目的蛋白的尿素溶液置于透析袋中，将透析袋放入装有 四倍以 上蛋白样品体积的复性液PBS溶液的

7、烧杯中，在预设环境温度（4C, 25和37C 等）下，用磁力搅拌器中速地搅拌复性液，以加速溶液的渗透和扩散。每隔一定 时间（4C约3-4h，25C、37C约2-3h）更换新的复性液，共4次。收集复性后 的样品，经4C，12000g离心10min，上清即为目的蛋白的复性液。（注：如果只需获得抗体，对蛋白纯度要求不高，则可以直接用蛋白的尿素样品 溶液作为免疫抗原；如果对蛋白纯度要求较高，则必须对蛋白进行复性才能作为 免疫抗原。）（七）抗体的制备（改良方法）（1）选用适龄的健康新西兰大白兔，从耳缘抽取0.5 mL血液，提取血清作为空 白对照； 用0.5-1mL约含500佃蛋白质的融合蛋白溶液与相同体

8、积的完全弗氏佐剂 充分混匀，分20个点对兔子进行皮下注射（如果蛋白浓度很高，可用PBS 稀释至0.5-1mL，（不）完全弗氏佐剂与蛋白溶液的体积比为1： 1 ）；（3）第3天，再次用0.5-1mL融合蛋白溶液与相同体积的完全弗氏佐剂充分混匀， 分20个点对兔子进行皮下注射;（4）第28天加强免疫：用0.5-1mL融合蛋白溶液与相同体积的不完全弗氏佐剂 充分混匀，分15个点对兔子进行皮下注射；（5）第35天采取颈动脉取血的方式获取足量血液，室温下静置2h，4C静置过 夜，上清即为抗血清。（八）抗体的检测用Western-blot的方法对制备的抗体进行检测。将约1g抗原进行点样， 抗血清作为一抗在

9、封闭剂中稀释200、500、1000、2000、5000倍。SDS-聚丙烯胺凝胶电泳（SDS）（1）配胶分离胶配方见表1,在烧杯里依次加入后，轻轻混匀，立刻倾倒入凝胶板中， 在室温下聚合30-60min,使之充分凝固（根据蛋白的大小选择分离胶的浓度， 分子量小的蛋白用高浓度胶，分子量大的蛋白用低浓度胶；一般厚胶的分离胶为 75mL左右，薄胶的分离胶为5mL左右）。表1分离胶配方胶的组分（10mL）10% (mL)12% (mL)15% (mL)超纯水4.03.32.330%丙烯酰胺溶液3.34.05.01.5mol/L Tris(pH8.8)2.52.52.510%SDS0.10.10.110

10、%过硫酸铵0.10.10.1TEMED0.0040.0040.004（注：灌注好分离胶后，需立即加入2-3mL的异丙醇压胶，以使胶的界面平 整。加入基层胶之前需用水洗去玻璃板中的异丙醇。积层胶配方（3mL）：在烧杯中依次加入2.1 mL超纯水、0.5mL 30%丙烯酰胺 溶液、0.38 mL 1.5mol/L Tris（pH6.8）、0.03mL 10%SDS、0.03mL 10%过硫酸铵 和0.003mL TEMED，轻轻混匀，在已聚合的分离胶上直接灌注积层胶，立即在积 层胶溶液中插入适当体积的点样孔梳子。在室温下聚合45min以上，使之充分凝 固（基层胶一般为2-3mL）。（2）电泳槽中加

11、入1 X SDS电泳缓冲液,点样之前进行10-20min的预电泳。（3）点样。薄胶可点样20-30p L，厚胶可点样30-50p L （western blot时点 样量较平时可适量增多），protein marker 点 10 L， prestain marker 点 5 L。 尽量使每个点样孔都有样品，空余的点样孔用10 L 6XSDS凝胶加样缓冲液填 充。（4）电泳。先用15-20mA的恒流电泳至基层胶和分离胶交界处；到达分离胶后 可增大电流至25-30mA电泳全样品跑至胶底部。（5）染色。将电泳完的胶放入培养皿中，加入适量考马斯亮蓝染色液，于脱色 摇床中摇30-60min （根据染色液

12、浓度的不同确定时间，时间不可过长）。（6）脱色。吸去考马斯亮蓝染色液（可重复使用），用清水冲洗去胶上的浮色， 在清水中加入适量KCl和（或）冰醋酸于脱色摇床中摇至脱色，注意隔一定时间 换水;或者用微波炉的中火加热脱色，注意火力不能太大，每次加热时间不能太 长，多加热几次，多加点水，防止水沸腾使胶爆裂。蛋白质印迹(Western blot)将含有目标蛋白的样品首先进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)；通过电转移的方法(恒压100v, 4C电转70min)将蛋白质转印至PVDF膜或硝 酸纤维素膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检 测；(转膜前注意挤走海绵中的气泡，放入转膜

13、槽中动作要迅速，防止海绵 干了产生气泡；PVDF膜在使用前需用甲醇浸泡；膜必须保持湿润，不能离 开水环境；注意转膜的方向：负极放胶，正极放膜；滤纸不能太大，最好同 膜和胶的大小一样)。 将转印好的膜用含5%脱脂奶粉的TBS缓冲液作为封闭剂封闭30-60min； 膜浸没在加入按比例用封闭剂稀释二抗的封闭剂中，于脱色摇床中摇1h以 上让稀释的抗体与膜结合(注意赶去封闭袋中的气泡;可将敷有一抗的膜于 4C保存过夜，次日再摇1h以上，以使抗体与膜充分结合)。用加入1%。 Tween20的TBS (TTBS)缓冲液洗膜4次，每次10min；将相对应的二抗加入封闭剂(如果一抗为鼠单抗，则加入羊抗鼠二抗；如

14、果一抗为兔多抗，则加入羊抗兔二抗)，使膜浸没其中于脱色摇床中摇虫。用 TTBS缓冲液洗膜4次；最后用DAB溶液显色。5-6mL PBS + 30u l HQ (双氧水)+ 100U l DAB (DAB有剧毒，注意戴手套操作；染色后需立即用大量清水冲洗以终止反应，膜需立即吹干或吸干水分以免使膜背景颜色加深)蛋白相关试剂一、SDS试剂PBS （磷酸缓冲液盐溶液）（pH7.4）：137 mmol/L NaCl2.7 mmol/L KCl10 mmol/L 卬2叫2 mmol/L 叩04用 800ml 蒸馏水溶解 8g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4 和 0.24g KH

15、2PO4O 用HCl调节溶液pH值至7.4，加水至1L。5X SDS电泳缓冲液1L配方： TOC o 1-5 h z Tris15.1g甘氨酸72.0gSDS5.0g加蒸馏水定容至1L6X SDS Loading Buffer：1M Tris-Cl（pH6.8）3.75mL甘油3mLSDS1.2g漠酚蓝0.02gDTT0.93g加蒸馏水定容到10mL -20 C保存考马斯亮蓝染色液：45mL蒸馏水45mL乙醇10mL冰乙酸0.5%1%考马斯亮蓝G250SDS电泳后1%考马斯亮蓝染色30分钟内即可脱色。0.5%可染色40分钟二、Western blot 试剂转膜缓冲液： TOC o 1-5 h z Tris3.05g甘氨酸14.4g甲醇150mL重要，不要忘记加加蒸馏水定容至1L 4C保存TBS洗膜缓冲液：Tris12.1gNaCl9g加蒸馏水800ml后加入浓盐酸7.5mL至pH78加蒸馏水定容至1L。使用前加入Tween20 1mL至终浓度1%。(标记为TTBS)封闭液：5%脱脂奶粉溶于TBS