超级感受态细胞的制备方法

1、什么是感受态细胞野生型E.coli并不容易转化，这是由于细菌产生一种酶能迅速降解进入的外 源DNA。经过多年的努力，科学家们发现了一种方法可以增加细胞吸收外源 DNA的效率。那就是用化学方法处理细胞，使其改变膜对DNA的通透性。这 种细胞就称为感受态细胞，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。这种方 法已经成为基因工程的常规技术，它对于我们利用体外DNA重组技术来了解真 核和原核生物的基因功能特别重要。细菌的转化有两种类型：一种是自然转化(natural transformation)，在自然转化中细菌可以自由地吸收DNA，通过它来进 行遗传转化；另一种是工程转化(engineered tra

2、nsformation)，在这种转化中， 细菌发生改变使得它们能摄入并转化外源DNA。枯草杆菌中的转化属于自然转 化，E.coli转化就属于工程转化。DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒 载体转化时，可与载体编码的。一半乳糖苷酶氨基端实现a一互补。可用于蓝白 斑筛选鉴别重组菌株Transformation Ultra-Competent E. coli(Inoue Method)Inoue法制备大肠杆菌超级感受态细胞Inoue, H., H. Nojima, and H. Okayama. 1990. High efficiency transform

3、ation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96:23-28. Citation AbstractProcedure 步骤Inoculate from an overnight grown in LB.从培养过夜的LB平板上挑取单菌落Grow in 250 ml SOB at 18C until OD600 = 0.6.(0.3)接种于 250mL SOB，18 度培养至 OD=062. On ice for 10 minutes.菌液置冰上 10 分钟Spin at 2500 x g (5000 rpm in a Sorvall GSA or

4、3000 rpm in a Beckman J-6B centrifuge) for 10 min. at 4C. 4 度2500g离心10琴钟Resuspend cells gently in 80 ml of ice cold TB.小心用 80mL 预冷 TB 重悬细胞On ice for 10 minutes. (30min)菌液置冰上 10 分钟Spin at 2500 x g (5000 rpm in a Sorvall GSA, 5500 rpm in a Sorvall SS-34, or 3000 rpm in a Beckman J-6B centrifuge) for 1

5、0 min. at 4C. 4 度 2500g 离心 10 分钟Resuspend cells gently in 20 ml of ice cold TB.小心用 20mL 预冷 TB 重悬细胞Add DMSO to a final concentration of 7%.加入 DMSO 至终浓度 7%Place on ice for 10 minutes.置冰上 10 分钟Aliquot into 1-2 ml and freeze in liquid nitrogen.分装，液氮速冻Store in liquid nitrogen.冻存SOB Medium and TB (Transfo

6、rmation Buffer)SOB2% (w/v) bacto tryptoneTB0.5% (w/v) yeast extract10 mM Pipes10 mM NaCl55 mM MnCl22.5 mM KCl15 mM CaCl210 mM MgCl2250 mM KCl10 mM MgSO4在加入MnCl2之前先用5N KOH调pH值到6.7，adjust pH to 6.7 with 5N KOH prior to adding the MnCl2thanks to Markus Schneemann for the tip!pH 6.7 - 7.0JM108感受态细胞的制备刚开

7、始做实验时，是向TAKARA购买的，一支30元，定了 10支。后来干 脆自己做，感觉质量和TAKARA的质量不相上下，下面谈谈我制作感受态的体 会。前期工作分子生物耗费时间在于准备过程太多。所以做好前期工作非常重要，所谓磨刀 不误砍材功。注意事项不要用经过多次转接或储于4。0的培养菌，最好从一70C或-20C甘油保存的菌 种划板（AMP阴性）37度过夜培养，划板时用小TIP头挑少许冰渣即可，轻划 S行。同时记得设立对照：A、在AMP阳性板划菌，排出AMP抗性菌污染。 大家都知道，实验室很多材料从师姐传师妹，或许经过很多人的转手。所以从 头鉴定所用材料的可靠性非常必要。B、AMP阴性空白培基。系

8、统控制参照， 为更准确起见，用TIP头不沾任何东西进行划板。第二天挑克隆。质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA（cccDNA）。 转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过 多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50l的感受态细胞 达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。不过 我一般链接反应后（TAKARA的链接酶，体系25微升）会全量加到200微升的 感受态里，约为150ng （载体0.1微克，日的片段约0.05微克）。效果也好。试剂的质量:所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的（GR

9、.或AR.）,并用超纯 水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。国产的当然也可以。我用都是国产的， 好像是陇西化学制剂，分析纯。防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿, 如离心管，tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌,且注意 防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA 的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。培养基的配制1.配制LB-AMP抗性培养基LB液体培养基：精解蛋白胨10g，酵母抽提物5g， 氯化钠l0g，加去离子水800ml充分搅拌溶解，用1mol/LNaOH调pH7.0，补加 去离子水至1000毫升，

10、高压灭菌，4度保存。我一般没有用1mol/LNaOH调pH7.0。而是直接精解蛋白胨10g,酵母抽提物5g,氯化钠10g加去离子水至1000ml。LB固体培养基：LB液体培养基中加1.5%琼脂粉，高压灭菌消毒；Amp母液：用无菌水或生理盐水配制成100mg/m1即100 ug/ul溶液，置-20笆保 存；AMP500mg/支，一支用5ml稀释即得。然后分5支分装（浓度100mg/m 1即 100 ug/ul）。含Amp的LB固体培养基：将配好的LB液体培养基高压灭菌后冷却至60C 左右，加入Amp储存液，使终浓度为100ug/ml摇匀后铺板（30ml/90mm）：即多少 毫升培养基加多少微升上

11、述的Amp母液多少毫升培基=加多少微升母液，或减 半量则最终浓度为50ug/ml有指南上写细菌转化后37度复苏时用SOC培基。我从来只用AMP阴性的普通 培基，效果也很好。5.0.05mol/L CaCl2溶液:我们实验室只有CaCl2-6H2O,分子量219,配制100ml 的，则需称量0.005x219=1.095g就可以了。其实氯化钙的摩尔浓度在 0.05-0.1mol/L均可。溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2:先配制成0.1mol/L的氯化钙溶液50ml，加入 15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。有文献说要用0.2

12、2的滤器，其实完全没有必 要。高压即可。准备工作做好了，就可以开工了。一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的JM109单菌落，接种于3-10ml LB 液体培养基中,37C下振荡培养12小时左右（一般过夜）。将该菌悬液以1:100-1:50 的比例接种于10ml试管（如较多制备，多用几个试管即可）的LB液体（AMP 阴性）培养基中同时做空的培基对照,37。振荡培养2-3小时至OD600 =0.5左 右。二、感受态细胞的制备（CaCl2法）1、将培养液分转入1.5ml的离心管中（一管10ml菌液可分装成约6管1.5ml的 离心管中），冰上放置10分钟，然后于4C下3000g离心10分钟。2、弃去上清