酶工程重点背

1、1、问答：为什么说酶活性部位的柔性是其充分表现活性所必需的？答：1）、诱导契合：满足底物结合诱导的构象改变，以使酶活性部位的活性基团形成一定的空间取向，从而保 持一个适应催化反应的空间微环境；2）、残基侧链活性基团的运动更加有利于酶催化的高效性；3）、很多酶的催化效率和底物专一性都受其他因素调节，这就要求酶的活性部位保持一定的柔性，使其 局部环境受调节因素影响后能发生细微构象变化，从而调节酶的活性和底物专一性。2、问答：辩证谈“酶的柔性和刚性是局部的，也是相对的”。答：1）、对于局部柔性部位必须要由其刚性部分来支持；2）、酶分子既要有相对稳定的整体结构，又要有相对柔性的微环境状态。正是这种刚柔

2、相济的独特酶分子 结构，构成了酶催化反应高效性和可调节性的结构基础。3、问答：如何理解“Km可了解酶的底物在体内具有的浓度水平”？答：由Km的式子（列出），一般来说作为酶的最适底物，其在体内的浓度水平应接近于它的Km值。1）、若体内S0 Km，则V Vmax，说明大部分的酶在体内是不起作用的，处于一种浪费的状态;2）、若体内S0 Km，则VVmax，这种底物浓度会失去生理意义，也不符合实际。4、区别可逆抑制和不可逆抑制作用的动力学方法:1）、方案一：当混合液加入底物时，对3而言，相当于将酶和抑制剂均稀释了，取出的混合液体积越小其被稀释的倍数 也就越大，体系中抑制剂的浓度也就越小，相应的抑制作用

3、就越弱。（2-不可逆抑制剂仅降低酶浓度）2）、方案二：固定反应体系体积，加入一定量抑制剂一一加不同浓度的酶一一测酶活。未加抑制剂加入不可逆抑制剂OE加入可逆抑制剂OE初速度对酶浓度作图，对2而言，当加入的是一定量不可逆抑制剂，那么一定量酶失活，只有加入的酶量 大于不可逆抑制剂的量时才能表现出酶活力；对3而言，加入可逆抑制剂只是降低了反应速率，得斜率降低的 直线。（记：体积同，抑制剂量同，酶浓度不同）3）、方案三：固定反应体积，加入不同浓度的抑制剂测定不同酶浓度下的酶活。（体积同，浓度均不同）V f/ 1 P TOC o 1-5 h z （a） -可逆抑制剂作用/ /（b） -不可逆抑制剂作用/

4、,/EE1（a）（b）对可逆抑制剂，抑制剂浓度增加时（箭头向下），酶浓度增加，反应速度仍呈直线缓慢增加；对不可逆抑 制，抑制剂浓度增加（向右），酶浓度要超越抑制剂浓度后才表现出活性，故直线斜率相同，向右移动。丙二酸抑制琥珀酸脱氢酶：可逆竞争性抑制；琥珀酸抑制琥珀酸脱氢酶：底物抑制。5、可逆抑制作用：抑制作用类型KmVmax能否用增大底 物浓度的办法 消除抑制作用双倒数图的特点竞争性抑 制增大不变能交于纵轴上的一点（1/Vmax）线性非竞争性抑制不变变小否交于横轴上的_点（-1/Km）反竞争性抑制变小变小否一组平行线6、问答：别构酶的生理调节功能是什么？答：分为正协同效应和负协同效应：1）、正协

5、同效应：可以使反应底物的浓度在很窄的范围内即快速而大量地合成产物，并能调节参与几个不 同代谢途径的底物，使之在各个代谢途径中得到合理分配；2）、负协同效应：使酶促反应对配体浓度相对不敏感，从而得以保证代谢中某条重要途径能够较为稳定的 进行下去；总之，别构调节是快速影响酶活力的一种重要方式，受到别构调节的酶通常处于代谢途径的起始点或者分 叉点，也可能处于代谢途径中的关键位点或者限速位点上，在体内的代谢调节中有很重要的作用。7、通过延长10- 23核酶的结合臂的长度，将会对该酶催化底物反应的Km和Kcat产生什么影响？答：脱氧核酶（deoxyribozyme,DNAzyme/Dz），不同催化活性的

6、Dz具有不同的结构，但基本上都由催化部位和臂 构成。底物序列改变，只要酶的底物结合臂以互补的方式改变并不会影响，其中要注意保持酶与底物的配对方 式。如果延长结合臂后酶与底物亲和性增加，Km减小，Kcat因转化能力增强而变大（问！）。iii 111111 In ihii 1131 J R 57* G TOC o 1-5 h z !GcATA；10-23仁心酉 （ref. 29）8、酶的固定化包括：1）、空间障碍：使得其他大分子难以与酶接近和作用，可以防止蛋白水解酶和蛋白抑制剂的作用，也可以防 止化学失活；2）、分配或扩散限制：酶被固定化后，尤其是在包埋法固定时，底物必须先扩散到载体表面，然后才能

7、进入 内部与酶作用，此时由于扩散限制使得反应速度对酶浓度的依赖性较弱而对底物的获得依赖性较强，酶的“稳 定化”程度增加；3）、抑制酶的自降解：固定化后可使酶的构象更加牢固，能阻止酶从折叠态到伸展态的过渡。9、为什么溶氧速率等于或稍高于耗氧速率即可？1）、浪费;2）、高溶氧速率会抑制某些酶，如青霉素酰化酶的合成；3）、为获得高溶解氧速率而采用的大量通气或快速搅拌等措施会对某些细胞造成损害。所以，溶解氧速率应该等于或稍高于耗氧速率，耗氧速率=细胞呼吸强度x细胞浓度。10、问答：为什么说延续和成型是酶工业生产中最理想的合成模式？答：属于这一类型的酶在发酵过程中没有生长期和产酶期的差别，细胞开始生长便

8、有酶的产生，直到生长进入 平台期后，酶还可以继续产生一段较长的时间。11、发酵液预处理的目的是什么？1）、改变悬浮液中固体离子的物理特性，如提高硬度、加大颗粒尺寸、改变表面类型等；2）、使某些可溶的胶黏物质变为不可溶；3）、改变液体的某些物理性质，如降低粘度和密度；4）、产胞内酶的细胞还需对细胞进行处理，以使其胞内酶能最大限度地释放。总之，预处理的目的就是要使发酵液中的酶易于通过分离、过滤而与发酵液中的其他成分分开。12、SDS的原理是什么？答：SDS:断裂分子内和分子间的氢键，使之去折叠；强还原剂：使二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂，蛋白质分子被解聚，解聚后的AA侧链与SDS充分

9、结合形成带负电荷的蛋 白质-SDS胶束，其所带负电荷大大超过蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了分子间原有的电荷差异。蛋白 质-SDS胶束在水溶液中的形状像一个长的椭圆棒，棒的短轴对不同蛋白质亚基-SDS胶束基本上相同，长轴的 长度则与蛋白质亚基分子量的大小成正比。所以这种胶束在SDS凝胶系统中的电泳迁移率不再受分子本 身电荷量的影响，而主要取决于椭圆棒长轴的长度也即是蛋白质或亚基的分子量大小。13、为什么说目前获得的核酶、脱氧核酶与蛋白类酶在催化类型和活力上都相差甚远?答：1）、就蛋白质和核酸本身的化学组成来看，蛋白质更具催化潜能；2）、目前核酶、脱氧核酶很多结构和功能还远未被开发；3）、目前

10、的体外选择无论在时间还是空间上都有限。14、培养基配制中，碳源的选择原则：对酶生物合成的调节作用。1）、诱导作用：乳糖、IPTG （乳糖类似物）诱导8 -半乳糖苷酶合成；纤维二糖（纤维素酶催化反应产物）诱 导纤维素酶合成；2）、分解代谢物阻遏作用：葡糖糖阻遏8 -半乳糖苷酶合成（利用碳源分解代谢的产物阻遏酶的生物合成，主 要针对诱导酶；3）、反馈阻遏作用：产物阻遏，反馈抑制。15、问答：对酶进行化学修饰的目的为什么？答：1）、研究酶的结构与功能：化学修饰酶分子功能基团，测定酶活改变以确定氨基酸残基的功能、某一氨基 酸的数量、酶的空间结构；2）、增强酶天然构象的稳定性与耐热性：酶热失活是酶分子的

11、天然构象向热力学上熵值增高的方向变化， 即从紧密有序趋于随即松散，去折叠，最终丧失催化功能。酶化学修饰从增强天然酶构象的稳定性着手来减少 酶热失活。酶与修饰剂交联后可使之天然构象产生“刚性”，不易伸展打开，同时减少分子内部的热振动以增 强酶的热稳定性。3）、保护酶的活性部位与抗抑制剂：阻断酶抑制剂与酶结合。酶经化学修饰共价交联上大分子修饰剂后， 修饰剂产生的空间障碍或静电斥力可有效阻挡抑制剂对酶的进攻，并“遮盖”酶的活性部位，增加抑制剂与酶 结合的难度，抗抑制剂能力增强。4）、维持酶结构功能的完整性与抗蛋白水解酶：蛋白水解酶一般作用于敏感键以断裂多肽链。酶分子交联 上大分子修饰剂后，由空间障碍

12、作用能阻挡蛋白水解酶接近酶分子，并“遮盖”敏感键。同时酶分子上的敏感 基团大多参与修饰反应，减少受蛋白水解酶破坏的可能性。5）、消除酶的抗原性及稳定酶的微环境：酶的化学修饰使组成抗原决定簇的基团与修饰剂形成共价键，从 而降低或消除酶的抗原性。大分子修饰剂也能“遮盖”抗原决定簇以阻碍结合反应；维持微环境的平衡被破坏， 酶分子伸展，故经化学修饰一方面能减少由内部平衡力破坏而引起的酶分子伸展，另一方面可在酶分子表面形 成一层“缓冲外壳”，一定程度上抵御外界环境的电荷、极性作用，维持微环境相对稳定。一些概念：1、模拟酶（人工酶0酶模型）：分子水平-模拟-酶结构特征（活性部位大小、性状、微环境等）、作用

13、机 理、立体化学等特性。（分子水平模拟生物功能）2、酶：生物催化剂，具生物催化功能的生物大分子，生物体产生，在体内外均有活性。3、1896年，由Buchner兄弟首先发现，其用石英砂磨碎酵母细胞或无细胞滤液均能和酵母细胞一样进行 酒精发酵，标志着酶学研究的开始。4、现状：目前大规模利用和生产的商品酶还很少。中英文对照：extraction separation 萃取分离feedback inhibition 反馈抑制feedback repression反馈阻遏作用fermentation 发酵fermentation kinetics 发酵动力fermentation production

14、发酵生产filtration 过滤gel electrophoresis 凝胶电泳gel filtration 凝胶过滤general acid-base catalysis 广义酸碱催化ground state 基态hammerhead structure 锤头结构high speed centrifuge 高速离心机holoenzyme 全酶host-guest chemistry 主-客体化学hydrogen bond 氢键hydrophobic interaction 疏水相互作用hydrolase水解酶hydrophobic chromatography 疏水层析immobiliza

15、tion 固定化*immobilization method 固定化方法immobilized cell固定化细胞immobilized enzyme 固定化酶immobilized protoplast固定化原生质体immune affinity chromatography 免疫亲和层析induced fit hypothesis 诱导契合学说inducer诱导物inorganic salt 无机盐intervening sequence 间隔序歹0ion exchange chromatography 离子交换层析ionic bond 盐键irreversible inhibition

16、不可逆抑制irreversible inhibitor 不可逆抑制剂isoelectric focusing 等电聚焦isoelectric point 等电点isoelectric precipitation 等电点沉淀isoenzyme同工酶isomerase异构酶lectin affinity chromatography 凝集素亲和层析ligase连接酶lock and key theory 锁钥学说low speed centrifuge 低速离心机lyase水解酶main chain modification 主链修饰mass spectrometry 质谱分析membrane s

17、eparation technology 膜分离技术metabolite repression分解代谢物阻遏作用metal ion affinity chromatography 金属离子亲和层析metal ion substitute modification 金属离子置换修饰Michaelis constant 米氏常数mimic enzyme 模拟酶molar catalytic activity 摩尔催化活性molecular chaperone 分子伴侣molecular engineering of the enzyme 酶的分子工程molecular imprinting 分子印

18、记multifunction ribozyme 多功能核酶multienzyme complex 多酶复合体multienzyme conjugate 多酶融合体native structure 天然结构absolute specificity 绝对专一性absorption chromatography 吸附层析abzyme抗体酶activator激活剂active center活性中心active energy 活化能affinity chromatography 亲和层析affinity modification 亲和修饰allosteric enzyme 别构酶allosteric e

19、ffector 别构效应物allosteric modulator 别构调节物amino acid substitute modification 氨基酸置换修饰apoenzyme脱辅基酶apoprotein脱辅基蛋白auxiliary residue 辅助残基binding energy 结合能biological catalyst 生物催化剂biosynthesis生物合成bond specificity 键专一性carbon source 碳源catalytic activity 催化活性catalytic antibody 催化性抗体cell growth kinetics细胞生长动力

20、学centrifugal force 离心力centrifugal speed 离心速度centrifugation 离心centrifuge离心机，离心chromatofocusing 层析聚焦chromatography 层析coenzyme 辅酶cofactor辅因子competitive inhibition 竞争性抑制competitive inhibitor 竞争性抑制剂concentration 浓缩conformational change 构象变化constitutive enzyme 组成酶contact residue 接触残基contributing residue 贡

21、献残基covalent affinity chromatography 共价亲和层析covalent modification 共价修饰crystallization 结晶culture medium 培养基density gradient centrifugation 密度梯度离心deoxyribozyme 脱氧核酶differential centrifugation 差速离心double reciprocal plot 双倒数作图dye ligand affinity chromatography 染料-配体亲和层析 electrophoresis 电泳energy barrier 能障

22、enzyme 酶enzyme activity 酶活性，酶活力enzyme application 酶的应用enzyme biosynthesis酶的生物合成enzyme classification 酶的分类enzyme engineering 酶工程enzyme immobilization 酶的固定彳化enzyme molecule modification 酶分子修饰enzyme production 酶的生产enzyme production kinetics 产酶动力学equilibrium constant 平衡常数non-contributing residue 非贡献残基nu

23、clear magnetic resonance 核磁共振organic solvent precipitation 有机溶剂沉淀oxidoreductase氧化还原酶phosphatase 磷酸酶physical modification 物理修饰plant cell culture植物细胞培养polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳precipitation 沉淀prosthetic group 辅基protein kinase 蛋白激酶purification 纯化rate constant速度常数rate-limiting step 限速步骤reaction intermediate 反应中间产物reactive oxygen species 活性氧regulatory enzyme 可调节酶relative centrifugal force 相对离心力relative specificity 相对专一性reverse osmosis 反渗透reversible inhibition 可逆抑制reversible inhibitor 可逆抑制剂reversible phosphorylation 可逆磷酸化rib