pcr技术简介(学生版)

1、RCR技术的发展历程PCRPolymerase chain reaction多聚酶链式反应体外特异性地扩增DNA片段的技术。PCR技术的发展阶段孕育诞生成熟孕育阶段 人类致力于核酸的研究开始于上个世纪，近一百年的历史。然而由于核酸的含量较少，在一定程度上限制了DNA的体外操作。科兰纳（Khorana,Har Gobind）印度-美国化学家其在1971年最早提出了核酸体外扩增的设想：经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。我们从现在来看，科兰纳的理论就是PCR技术。但是当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现

2、，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段等等一系列技术理论的限制，所以他没能将PCR从纸上带到现实中。诞生卡里B穆利斯 (Kary BMullis)1985年发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。他也因此获得了1993年得诺贝尔化学奖。如果你的研究能力一般，那么，改革本研究领域中大家习以为常的最基本的技术，你就有可能获诺贝尔奖。成熟PCR技术是诞生了，但并不成熟。比如，穆利斯最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶，这种酶有一个缺点，不耐热。那么每完成一个扩增周期就要从新加入一次酶，很麻烦。成熟但经过科学家的不懈努力，PCR技术得以成熟：1988年初，K

3、eohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，使扩增的片段均一，真实性较高。1988年，Saiki 从温泉中分离得到的一株水生嗜热杆菌中得到一种耐热的DNA聚合酶。它的应用使得PCR技术得到广泛的应用。PCR原理简绍PCR的扩增过程模拟体内DNA的天然复制过程，利用一种从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分离出的具有热稳定性的DNA 聚合酶，及碱基互补配对原则。通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的多次循环,最终使基因扩增形成特异区段的DNA带，实现DNA在体外的特异性扩增。Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶活性(%)温度()40

4、50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20PCR的操作步骤PCR由变性-退火(复性）-延伸三个基本反应步骤构成变性模板DNA的变性：模板DNA经加热至941min后，模板DNA双链即解离成为单链，以便之后引物结合，为下轮反应作准备退火 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至54 45s，以便使引物与模板DNA单链的互补序列配对结合延伸引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，于72左右，以dNTP为反应原料，DNA序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链实验室的实际操作1.

5、设计引物2.PCR体系配置3.PCR4.产物的琼脂糖电泳检测设计引物 此步骤实际为PCR整个过程中最为关键的一步。 目前一般采用计算机软件设计引物，之后交由生物技术公司对引物进行生产，常用的引物设计软件有Primer Premier5.0 一般的引物设计需要注意遵守的原则 （1）引物长度 一般引物长度不宜太长，应控制在15-40 bp左右，引物长度过长会引起退火时结合的模板数减少，降低反应效率 （2）引物的3末端的碱基不能进行修饰 引物3端为关键碱基，是PCR延伸的起始端，不能进行任何修饰，也不能形成二级结构的可能，一般3端也不能发生错配 （3）引物的特异性 引物应与核酸序列数据库的其它序列无

6、明显同源性，以免造成不必要的非特异性扩增。 （4）GC的含量 一对引物的GC含量和Tm值应该协调， G+C一般占40-60%。根据公式Tm=4（G+C）+2（A+T）,可估计引物的Tm值。 （5）两引物间避免有互补序列 一般来讲，引物自身连续互补碱基不能超过3个，一对引物间也不易多于四个连续碱基的互补性。 （6）引物内部避免形成二级结构 采用计算机软件可以预测估计mRNA的稳定的二级结构，有助于选择模板。PCR体系配置及扩增 根据标准体系配置母液，根据实验要求取适量pcr管，取少量模板DNA与母液混合，上加少许石蜡油密封，之后放入PCR仪中，根据预先设定程序反应即可标准的PCR反应体系：10扩

7、增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 800ul 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ulPCR产物的检测 将扩增后的产物利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，如果在扩增所需的基因分子质量大小处出现较为明亮的亮带，则可大致说明实验成功1953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋结构及半保留复制模型。1958年，Meselson和Stahl用实验证实DNA半保留复制模型。70年代以来，人们采用两种思路去尝试建立基因的无性繁殖体系，一是基因克隆技术，二是体外扩增技术。发展历程

8、1971年，Khorana（美国MIT教授，1968年诺贝尔医学奖得主）：“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。”核酸体外扩增最早设想被遗忘原因:（1）很难进行测序和合成寡核苷酸引物；（2）1970年Smith等发现了II型限制性内切酶，体外克隆基因已成为可能。1976年，台籍科学家钱嘉韵（Alice Chien）从黄石国家公园的嗜热菌Thermus aquaticus中分离出热稳定的Taq DNA聚合酶。1985年，美国Cetus公司人类遗传研究室的Mullis发明聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PC

9、R），Saiki等首次应用PCR法成功地扩增了人-珠蛋白的DNA，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。1988年Saiki开始将耐热性Taq DNA聚合酶应用于PCR，整个反应只加一次酶即可，扩增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。1989年被誉为“分子年”，列PCR为十余项发明之首。1993年，Mullis荣获诺贝尔化学奖。PCR技术的特点：高特异性引物的特异性。引物延伸时，碱基配对的正确性。Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性。靶基因的特异性与保守性。选择扩增特异性和保守性高的靶基因区域，扩增产物的特异性程度就更高。作为临床测定的PCR方法，还有一个影响特异性的决定性因素是寡核苷酸杂交探

10、针。PCR技术的特点：高灵敏度从理论上，其能在23小时内，将1个分子靶DNA，扩增至10亿个分子。而就特定的扩增反应来说，从理论上，只要反应管中有1个分子，就能将其扩增至能检出的水平。如将一些干扰因素考虑在内，一个反应体系中，如有23个以上的靶分子，即可成功的通过PCR扩增，将其检测出来。PCR技术的特点：简便快速整个PCR的扩增在一个小小的离心管中完成，过程也只是简单的温度变化，耐高温的Taq DNA聚合酶的应用，避免了DNA聚合酶的反复加入。整个扩增反应可在24 小时完成。 特定的低纯度标本也可使用某些靶基因含量高的标本，如人的组织、细胞、毛发、血液、培养后的细菌和病毒等病原体等，DNA粗

11、制品及总RNA即可作为扩增模板，但在具体的扩增时，可对标本进行适当的稀释，在不影响靶基因模板的扩增浓度下，降低标本中PCR抑制物的浓度，以利于靶基因的扩增。在遗传与分子生物学中的应用1制备与筛选CDNA文库2直接测定DNA序列3克隆染色体上特异性片段4介导与检测基因突变5克隆未知序列6寻找新基因7构建连锁图谱病原体核酸的检测：定量（抗病毒药物治疗疗效监测）；定性（耐药突变、基因分型、血液筛查等）。遗传病肿瘤个体鉴定其他（SNP及涉及核酸的科研等）PCR技术在医学上的应用在感染性疾病病原体检测中的应用病毒的检测 定量(感染状况判断、抗病毒药物治疗疗效监测） 定性(耐药突变、基因分型、血液筛查等）

12、细菌及其它微生物的检测 难培养菌 耐药基因寄生虫的检测地中海贫血地贫的发生是由于珠蛋白链基因突变的结果，珠蛋白基因定位于第16染色体短臂，每条染色体上均有两个珠蛋白基因，该基因总长30Kb，共包含七个连锁的类基因或假基因。 在-基因的突变中，以缺失型突变最为常见。-基因的另一突变即为点突变，目前已发现的突变有18种以上，它包括错义突变、无意突变、剪接部位突变及起始信号突变。 地贫的产前诊断目前一般采用PCR-探针杂交或限制性长度多态性（RFLP）方法进行。 在遗传病及其它基因相关疾病诊断中的应用地中海贫血地中海贫血（简称地贫）:地贫由珠蛋白链基因突变所引起，该基因定位于第11染色体短臂，总长度

13、约60Kb，其中有许多胚胎性基因及假基因，而珠蛋白基因有两个内含子和3个外显子，总长约为1.126Kb. -基因的突变以点突变为主，亦有碱基的插入和缺失。目前在世界范围内发现的点突变达160余种，其中在中国发现的有21种。地贫的产前诊断目前一般采用PCR-探针杂交或限制性长度多态性（RFLP）或等位基因特异的PCR方法进行。血友病血友病是一种X连锁隐性遗传病，分为血友病甲和血友病乙，几乎全部发生在男性身上。血友病甲是由于凝血因子的缺乏所致，而血友病乙则是因为缺乏凝血因子。控制产生凝血因子和的基因位于X性染色体上。 血友病的分子诊断大多数血友病突变的大量变异和近代起源使遗传筛选过程错综复杂。目前

14、基本上使用PCR方法检测。诊断携带者的最佳途径是检测其家庭成员的特异基因缺陷。策略：根据全国性可信基因突变和谱系数据库进行筛选，鉴定并记录每一个家庭中的病人或携带者的突变。这样，根据个人所属家庭，只有小部分血友病基因需要检查，所以可以迅速而准确地筛选每一个家庭成员并降低成本。英国和瑞典完全使用这种策略，它代表了利用各种遗传缺陷谱系鉴定遗传性疾病的筛选模式。药物性耳聋氨基糖甙类抗生素所致的耳聋可分为两类：一类因接受了中毒剂量而致聋；另一类是有遗传背景，即带有线粒体125rRNA基因AI555G均质性点突变基因。由细胞线粒体的遗传基因发生变异之故。即家族的变异基因可能通过母亲遗传给她的子孙，使之具

15、有潜在的过敏性，此称母系遗传。该突变使原有的BsmAI酶切位点消失药物性耳聋检测方法主要是运用 PCR技术，结合限制性内切酶进行分析，其更新的技术包括变性高效液相色谱分析等。在亲子鉴定中的应用每个人的遗传物质一半来自父亲，另一半则来自母亲。根据孟德尔遗传分离和自由组合定律，亲代基因型决定子代基因型，在没有基因突变和分型错误的前提下，孩子不可能带有双亲均没有的等位基因。父系遗传的Y染色体的标记，子代的分型必定与父亲的相同，而且同一父系的所有个体的分型一致。母系遗传的线粒体DNA，子代的分型与母亲的分型一致，并且同一母系的所有个体的分型一致。 在亲子鉴定中的应用父与子之间仅有一个遗传标志不符合遗传

16、规律尚不能排除亲子关系，因为有可能是突变所致。必须有2个以上不同基因座同时不符才能否定其亲子关系。亲子鉴定的手段主要有两大类: (1)血液中各种抗原成分的遗传多态性标志物检验,如人类白细胞抗原分型、红细胞抗原分型、红细胞酶型及血清型；（2）DNA多态性检验。主要包括有单基因座探针限制性片段长度多态性（DNA指纹）和单基因座扩增片段长度多态性（包括用多聚酶链反应(PCR) 检测的可变数目串联重复多态性(VNTR)和短串联重复多态性(STR)）。 在亲子鉴定中的应用DNA多态性检验是目前亲子鉴定中最准确的一种方法。如果孩子和被测试男子的DNA模式在两个或多个DNA探针上不吻合,那么被测试男子便被1

17、00%排除,即他是亲生父亲的可能性是0%。反之，如果孩子和被测试父亲的DNA模式完全吻合,则在理论上不能100%肯定其为亲生父亲，只能计算出99.95%或更大的概率。事实上也发生过DNA模式完全吻合但实际并非为生父的情况，但这种情况的可能性极低。 在个体鉴别中的应用基因指纹又称DNA指纹，指的单基因座探针限制性片段长度多态性。DNA所含有的遗传信息是由遗传密码字母A、C、G和T的序列决定的。人类含有总数约30亿个这种字母，它们在人体每个细胞的染色体上都以一定的次序排列，排列次序的不同使得一个个体与另一个个体完全不同。个体间的亲缘关系相距越远，基因组的核苷酸字母排列差异就越大。相反，遗传上相关的

18、个体（如同胞、父子）相应地在其字母序列上有很大的相似性。 在个体鉴别中的应用DNA指纹就是通过分析这种差异来确定个体。 DNA指纹是最可靠的个体确认方法，现已在司法实践中广泛应用，有很多案例的唯一证据就是留在现场的这些藏在细胞内的DNA。在个体化治疗中的应用细胞色素氧化酶P450（CYP450基因的多态性细胞色素P450 2D6（Cytochrome P450 2D6，CYP2D6）是细胞色素药物代谢酶中较为重要的一种，由497个氨基酸组成。主要参与多种重要药物的代谢，包括多种抗心律失常药、1受体阻滞药、抗高血压及三环类抗抑郁药等。CYP2D6参与代谢的药物占总P450代谢药物的30%。CYP2D6的基因多态性会导致患者代谢药物能力的很大差别。当患者的基因型是CYP2D6*1/*1时，属于强代谢型（EM）；当患者的基因型是CYP2D6*1/*10时，属于中等代谢型（IM）；当患者的基因型是CYP2D6*10/*10时，属于弱代谢型（PM）。同样是美托洛尔用药的常规剂量为25mg/次，2次/d，对于EM者，推荐剂量为常规剂量的140%；对于IM者，推荐剂量为常规剂量的60%；对于PM者，推荐剂量为常规剂量的30%。可常规地应用不同的P450基因型来评价新药在临床试验中的疗效。在血液筛检中的应用HCV和HIV感染“窗