蛋白质和氨基酸

1、第八章 蛋白质和氨基酸的测定第一节 概述1. 蛋白质概况 蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。 在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有非蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素）。1食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非蛋白氮多的要单测）。蛋白质是生命的物质基础，人体11%13%总热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类

2、型不同。蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味。2蛋白质的测定方法分两大类： 一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量； 另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。具体测定方法：凯氏定氮法最常用的，国内外应用普遍。双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法国外： 红外分析仪3氨基酸总量酸碱滴定法测定。各种氨基酸的分离与定量色谱技术。有多种氨基酸分析仪。4第二节 蛋白质的定性测定一、蛋白质的一般显色反应电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并变色。书中列举了 5 种染料。二、复合蛋白质的显色反应（一）糖蛋白的显色（3

3、种方法）（二）脂蛋白的显色（2种方法）5第二节 蛋白质的定性测定一、蛋白质的一般显色反应1. 氨基黑法2. 溴酚蓝法3. 考马斯亮蓝法4. 酸性品红法5. 氨基萘酚磺酸法6第三节 蛋白质的定量测定 一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。例如牛肉中蛋白质含量为 20.0%左右，猪肉 9.5%， 兔肉 21%， 鸡肉 20%， 牛乳 3.5%， 带鱼 18.0%， 大豆 40%，面粉 9.9%， 菠菜 2.4%， 黄瓜 1.0%，苹果 1.4% 测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意

4、义。7一些蛋白质的含氮量 一般为 15% 17.6%，有的上下浮动可以测出总氮 N一、凯氏定氮法 由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。书中只介绍前三种。= N6.25 = 蛋白质含量8（一）常量凯氏定氮法1. 原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。9整个过程分三步

5、：消化、蒸馏、吸收与滴定1. 消化 总反应式：加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点 340，加入硫酸钾之后可以提高至400以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用浓硫酸（98%）10 加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。 加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。11仪器：要防止爆沸。另外：介绍“自动回流消化仪”122. 蒸馏 消化液 + 40%氢氧化钠加热蒸馏，放出

6、氨气。133. 吸收与滴定用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红溴甲基酚绿混合指示剂）国标用亚甲基兰+甲基红。 指示剂 红色 绿色 红色 （酸） （碱） （酸） 用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。吸收滴定14 操作方法：121页，其中讲“以奈氏试 剂”检查氨是否全部蒸完，以奈氏试剂Nessler试剂，K2（HgI4） 检验NH4+离子，遇铵根，离子析 出黄色或红棕色沉淀。配制方法1、 3.5 g KI + 1.3 g HgCl2 溶于70 毫升水。加30毫升4 mol/L氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必

7、要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。15方法2、 溶解11.5 g HgI2 + KI 10 g于适量少许水，后加水稀释至50 ml,静置后，取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。结果计算：121页 注意：F氮换算为蛋白质的系数，一般为 6.25 也可查表。说明： 所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。16 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。 样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热

8、，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30过氧化氢 23 m1 后再继续加热消化。17 若取样量较大，如干试样超过5 g 可按每克试样5 m1的比例增加硫酸用量。 般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。 蒸馏装置不能漏气。18 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氢氧化铜在7090时发黑。

9、蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸。19二、微量凯氏定氮法1、原理及适用范围同前2、与常量法不同点：加入硼酸量有50 ml 10 ml,滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L ,可用微量滴定管。3、蒸馏装置 。2010-210-221三、自动凯氏定氮法1、原理及适用范围同前 2、特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样。22北京福德泰和科

10、技有限公司产品名称： 凯氏定氮仪 23二、双缩脲法 传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。新开发的：双缩脲法、 紫外分光光度法、 染料结合法、 水杨酸比色法等。241.原理脲（尿素）NH2CONH2 加热至150160时，两分子缩和成双缩脲。双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫红色色络合物，这种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）蛋白质分子中含有肽键 CONH 与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（560nm）NH2CONHCONH2 + NH3NH2CONH2 + NH2

11、CONH225注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化2.方法特点及应用范围本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。 3.主要仪器： 分光光度计，离心机（4000 r/min） 4. 试剂： (1) 碱性硫酸铜溶液 (2) 四氯化碳266说明及注意事项：a. 蛋白质的种类不同，对发色程度影响不大；b.标准曲线制作完整后，无需每次再做标准曲线；c.含脂肪高的样品应预先用醚抽出弃去；d.样品中有不溶性成分存在时，会给比色测定带来困难，此时可预先将蛋白质抽出后再进行测定；e.当肽链中含有脯氨酸时

12、，若有多量糖类共存，则显色不好，会使测定值偏低。27三紫外吸收法 （一）A280nm光吸收法1原理：蛋白质及其讲解产物（月示 胨 肽 氨基酸）的芳环残基R（ NHCHCO）在紫外区对一定波长的光具有选择吸收作用。280nm下，吸光度与蛋白质浓度（3-8mg/mL）成直线关系。用凯氏定氮法确定蛋白质含量的标样做标准曲线。282适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。3主要仪器： 紫外分光光度计 离心机（3000 5000 r/min）4操作：用凯氏法测定作标样做标准曲线295说明及注意事项a.测定牛乳样品时的操作手续：准确吸取混合均匀的样品0.2ml与25ml纳

13、氏比色管中，用95-97%的冰醋酸稀释到标线，摇匀，以95-97%的冰醋酸为参比液，用1cm比色皿于280nm处测定吸光度，并用标准曲线法确定样品蛋白质含量（标准曲线用凯氏定氮法测出蛋白质含量的牛乳标样绘制）。b.测定糕点时，应将表皮的颜色去掉。c.温度对蛋白质水解有影响，操作温度应控制在20-30。30三紫外吸收法 （二）肽键紫外测定法1原理：蛋白质溶液在238nm下均有光吸收，其吸收强弱与肽键多少成正比，可测定样品在238nm下的吸收值，与蛋白质标准液做对照，求出蛋白质含量。本法比280nm法灵敏。醇、酮、醛、有机酸和过氧化物等都有干扰作用，最好用无机酸、无机碱和水作为介质溶液。若含有有机

14、溶剂，可将样品先蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸或稀碱溶解后再做测定。50-500mg/L蛋白质范围线性良好。31四、福林-酚比色法1.原理：蛋白质与Folin-酚试剂反应，产生蓝色复合物。机理：蛋白质中的肽键与碱性铜盐产生双缩脲反应，同时，由于蛋白质中存在的酪氨酸与色氨酸同磷钼酸-磷钨酸试剂反应产生颜色，呈色强度与蛋白质含量成正比，是检测可溶性蛋白含量最灵敏的经典方法之一。2.试剂：福林-酚试剂甲、乙、牛血清蛋白标准溶液3.操作方法：P1274.说明：灵敏度高，实测下限较双缩脲法约小2个数量级。对双缩脲法有干扰的物质对本法影响更大。酚类、柠檬酸有干扰。32五、考马斯亮蓝染料比色

15、法1.原理：G-250与蛋白质通过范德华力结合，蛋白染色，在620nm处有最大吸收。2.特点：简单快速，适合大量样品测定，灵敏度类福林酚法，不受酚类、游离氨基酸和小分子的影响。3.试剂：牛血清蛋白标准液、G-2500-100mg/L线性关系良好。33六、水杨酸比色法1.原理：样品中蛋白经硫酸消化转化成铵盐溶液后，一定酸度和温度条件下与水杨酸钠和次氯酸钠作用生成蓝色化合物，660nm处比色测定，求出样品含氮量，计算Pro含量。2.说明：样品消化完全后当天进行测定结果的重现性好，样液放至第二天比色即有变化；温度对显色影响极大，故应严格控制反应温度；对谷物及饲料等样品的测定证明，此法结果与凯氏定氮法

16、基本一致。34七、红外光谱法1.原理：食品中不同功能基团吸收不同频率的辐射。对于蛋白质和多肽，多肽键在中红外波段（6.47m）和NIR波段（如3300-3500nm、2080-2220nm，1560-1670nm）的特征吸收可用于测定食品中的蛋白质含量。2.应用：红外牛乳分析仪、近红外光谱仪35八、4,4-二羧基-2，2-联喹啉【BCA】法1.原理：二价铜离子在碱性条件下，可被Pro还原成Cu+， Cu+和独特的BCA试剂相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个Cu+ ，形成紫色化合物。颜色深浅与一定范围Pro浓度成正比。2.应用：已用于Pro的分离和纯化中。优点：灵敏度与福林酚法相

17、似。微量BCA法的灵敏度（0.5-10微克）稍高于福林酚法；一步混合的操作比福林酚法更简单；所用试剂比F法简单；非离子型表面活性剂和缓冲液不对反应产生干扰；中等浓度的变性剂（4mol/L盐酸胍或3M尿素）不对反应产生干扰。缺点：反应产生的颜色不稳定，需仔细控制比色时间；还原糖对此反应产生的干扰比对福林酚法更大；不同蛋白质反应引起的颜色变化与福林酚法相似；比色的吸光度与蛋白质浓度不成线性关系。36九、比浊法1.原理：低浓度（3-10%）的三氯乙酸、磺基水杨酸和乙酸中的铁氰化钾能使提取的蛋白质沉淀形成蛋白质颗粒的悬浊液。其浊度可由辐射光传送过程中的衰减而确定，辐射光传送过程中的衰减是由于蛋白质颗粒

18、的散射造成的，衰减程度与溶液中的Pro浓度成正比。2.应用：已用于测定小麦面粉和玉米的Pro含量。3.优点：快速，15min内完成；结果不包括除了核酸外的非蛋白含量。4.缺点：不同Pro沉淀的速率不同；浊度岁酸试剂浓度的不同而变化；核酸也能被酸试剂沉淀。37十、杜马斯法（燃烧法）1.原理：样品在高温下（700-800）燃烧，释放的氮气由带热导检测器（TCD）的GC仪测定。测得的氮含量转换成样品中的Pro含量。2.操作：p1313.应用：适用于所有样品。AOAC方法992.15和992.23分别用于肉类和谷物食品。优点：燃烧法是凯氏定氮法的一个替代方法；不需要任何有害化合物；可在3min内完成；

19、最先进的自动化仪器可在无人看管状态下分析多达150个样品。缺点：仪器价格昂贵；非蛋白氮也包括在内。38第四节 蛋白质的末端测定一、N-末端测定-丹磺酰化法1.原理：蛋白质的-氨基与丹磺酰氯（DNS-Cl）反应，生成DNS-Pro，经水解生成DNS-aa。通过分析DNS-aa，可确定Pro的N-末端aa。2.仪器和试剂3.操作方法：P131-13239第四节 蛋白质的末端测定二、蛋白质及多肽C-末端测定及顺序分析（羧肽酶法）1.原理：羧肽酶作用于Pro或多肽，从C-末端aa残基开始顺序降解，并逐个释放出游离C端aa。CPACPBCPCCPY CPA使用最广泛 CPY作用范围更广，包括释放C-末端

20、Pro的特殊功能，适用于降解所有的aa。Aa释放的种类和数目随时间变化，经过一定时间间隔取出样品，酸化失活后用自动分析仪或HPLC 进行快速测定，初步确定C-末端基为何种aa。若以酶作用时间为横坐标，以所释放的各aa量为纵坐标作图，根据aa释放的动力学曲线可进一步判断和确定肽链C端的aa顺序。关键是测出第一个释放的是何种aa，一般采用两种以上C-末端测定方法，进行比较和验证才稳妥可靠。缺点：酶解反应连续进行，难以控制。几个aa降解速率相近，及几个相同的aa顺序毗邻排列时，结果难以确定。2.试剂：P1333.操作方法：P13340第五节 氨基酸的定性测定一、氨基酸的一般显色反应（一）茚三酮法（生

21、化试验）（二）吲哚醌法1.原理：各种aa与吲哚醌试剂能显示不同颜色，可借此辨认aa。氨对吲哚醌显色没有妨碍，但灵敏度较茚三酮法稍差，显色不稳定，颜色只有在干燥的环境中才能保存。2.步骤：P13541第五节 氨基酸的定性测定（三）邻苯二甲醛法是目前纸上层析、硅胶薄层层析荧光显色aa最灵敏方法之一，可用于aa溶液定量，并推广应用于乙内酰苯硫脲aa、多肽和Pro的检出和定量。aa纸上层析灵敏度0.5moL，硅胶薄层层析上为0.05-0.2 moL1.原理：邻苯二甲醛在2-巯基乙醇存在下，在碱性溶液中于aa作用产生荧光化合物，最适合的激发光和发射光波长分别为340nm和455nm。各种aa显现的荧光强

22、度不同，P1352.说明：滤纸上显现aa时，邻苯二甲酸浓度0.1%为宜。显色须有一定湿度，以便aa溶解，提高碰撞几率，使极性基团解离，促进反应趋于完全。42第五节 氨基酸的定性测定二、个别aa的显色反应（一）精氨酸的显色-坂口反应（二）胱氨酸和半胱氨酸的显色（三）甘氨酸的显色（四）脯氨酸的显色（五）丝氨酸和羟赖氨酸的显色（六）羟脯氨酸的显色（七）色氨酸的显色（八）酪氨酸的显色（九）酪氨酸和组氨酸的显色-Pauly反应43 第六节 氨基酸定量测定一氨基酸的一般定量测定（一）甲醛滴定法 1.原理：氨基酸本身有碱性 NH2基，又有 酸性 COOH 基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，与 NH2 结合，碱

23、性消失，再用强碱来滴定 COOH 基，用间接方法测定aa总量。2特点：简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果接近。适用于发酵工业，如发酵液中氨基氮含量的变化，以此了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，为控制发酵生产指标之一。脯氨酸与甲醛作用产生不稳定化合物，结果偏低；酪氨酸含有酚羧基，滴定时会消耗一些碱使结果偏高；溶液中有铵存在也可与甲醛反应，结果偏高。3.说明：适于食品中游离氨基酸的测定。 固体样品：粉碎，水萃取，测定萃取液；液样直接测定。 样品颜色深，可先脱色，再测定，或电位滴定法进行测定。 单指示剂法，结果稍低。 双指示剂法结果更准确。44（二）电位滴定法： 40%中性甲醛溶液

24、：以百里酚酞作指示剂，用 氢氧化钠将40%甲醛中和至蓝色。 0.1%百里酚酞乙醇溶液， 0.1%中性红50%乙醇溶液， 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。4操作：同时取两份样： + 中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和 样液中其它酸性物质。（酸度计pH8.2） + 百里酚酞+ 中性甲醛+ NaOH 滴，中和了 样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总 和。（酸度计pH9.2） 二者之差可计算氨基酸含量45（三）茚三酮的比色法原理：氨基酸在碱性溶液中与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物（脯氨酸除外），可比色定量。570nm。操作：p140-141说明:样品处理方法：活性炭吸附处理； 茚三酮受阳光、空

25、气、温度、湿度等被氧化呈淡红或深红色，用前需纯化。（活性炭处理）46（四）非水溶液滴定法原理：氨基酸在冰醋酸中显示出碱性，用高氯酸标准溶液滴定其含量。适合aa成品的含量测定。允许测定范围几十mg。操作：p141-142说明:能溶解于冰醋酸的aa，如赖氨酸、精氨酸等。 谷氨酸和天冬氨酸溶解于2mL甲酸中，再加20mL冰醋酸，直接用标准的高氯酸溶液滴定。（五）邻苯二甲醛法1.原理：邻苯二甲醛在2-巯基乙醇存在下，于碱性溶液中与aa作用产生荧光化合物，合适的激发光和发射光波长为340nm和455nm。各种aa荧光强度不同。47（六）三硝基苯磺酸法原理：三硝基苯磺酸（TNBS）在偏碱性条件下与aa反应

26、，先形成中间络合物，在光谱上有2个吸收相近的高峰，355nm和420nm附近。溶液一旦酸化，中间络合物转化成三硝基苯-aa（TNP-aa），420nm处的吸收值显著下降，350nm附近的吸收峰移至340nm处。利用这一特性，在420nm处或340nm处对aa进行定量测定。操作：p145-146说明:p14648（七）乙酰丙酮和甲醛荧光法原理：aa与乙酰丙酮和甲醛反应，生成N-取代基2,6-二甲基-3,5-二乙酰基-1,4-二氢吡啶，产生黄绿色荧光，用荧光分析法检测。P147（各种aa的发射波长和检测范围）操作：p14749二个别氨基酸的定量测定（一）赖氨酸的测定1.原理：用铜离子阻碍游离aa的

27、-氨基，使赖氨酸的-氨基可以自由的与1-氟-2,4-二硝基苯（FDNB）反应，生成 DNP-赖氨酸。经酸化和用二乙基醚提取，在波长390nm处有吸收峰，从而求出样品中游离赖氨酸含量。2操作：p1483.说明：添加一定量中性aa，如丙氨酸，增加总aa浓度，有助于赖氨酸-HCl浓度具有良好线性关系。 用醚提取酸性溶液，可将所有中性或酸性的DNP-aa衍生物除去，并把FD-WB的产物破坏，否则这些产物会产生干扰。50二个别氨基酸的定量测定（二）色氨酸的测定1.原理：样品中的Pro经碱水解后，游离的色氨酸与甲醛和含铁离子的三氯乙酸溶液作用，生成哈尔满化合物，具有特征荧光值，可进行定量测定。2操作：p1

28、483.说明：0-10mg/L色氨酸溶液范围内呈良好线性关系。51原理：苯丙氨酸与茚三酮及铜盐反应生成荧光复合物，其荧光复合物在激发波长365nm、发射波长490nm处可产生最大荧光强度，与标准aa对照，可求出样品中苯丙氨酸的含量，检测时加入L-亮氨酸-L-丙氨酸二肽能增强这一反应。（四）酪氨酸的测定原理：酪氨酸和1-亚硝酸-2-萘酚反应，生成有色化合物，此化合物在硝酸和亚硝酸钠存在的条件下加热，产生稳定的荧光物质，可用荧光法定量测定。（三）苯丙氨酸的测定52原理：在丙酮溶剂中，脯氨酸和吲哚醌反应形成蓝色化合物，能用以测定蛋白质水解液中的脯氨酸含量，一定条件下（包括pH，缓冲液浓度和吲哚醌浓度

29、），可以在其他aa存在下直接测定，不受羟脯氨酸的干扰。（六）羟脯氨酸的测定原理：羟脯氨酸在有过量的丙氨酸（减少其他aa的干扰）的条件下，用氯胺T氧化生成（五）脯氨酸的测定53（八）谷氨酸的测定原理：L-谷氨酸在大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶作用下脱羧释放出CO2，由测压法测得CO2释放量，计算出谷氨酸含量。（七）胱氨酸的测定原理：用亚硫酸盐使胱氨酸还原为半胱氨酸和S-半胱氨酸磺酸，其他含二硫键的物质也被还原。通过巯基被磷钨酸还原成钨蓝的反应测定半胱氨酸，从而定量出胱氨酸。非胱氨酸的巯基可在加磷钨酸前先加氯化汞与巯基结合。因反应pH为5，其他还原性物质如尿酸、VC也使磷钨酸还原，通过空白对照加以去除。5

30、4第七节 氨基酸的分离与测定 一薄层色谱法（薄层层析法（TLC 法）Thin Layer Chromatography简介： 近年来发展起来的一种微量而快速的层析方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层析。它的应用范围比纸上层析更广泛，常用来分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。55（一）原理： 取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf

31、值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。56Rf = a / bab样点溶剂前沿点样原点57优点： 展开时间短，一般在2030分钟，展开距离通常只需10 cm，且分离效果好。 层析后得到的斑点小而清晰。 能够使用多种显色剂。 点样量少，灵敏度高。（比纸层析高10100倍） 精确到0.01ug。 也可用于大量分离500 mg，作为样品制备层析。缺点：Rf值重现性比纸上层析差。分类：按层析的原理可分为：吸附、分配、离子交换、凝胶等。58（三）操作方法： 薄层板制备 样品液制备 点样：距薄板底端2c

32、m处，用针画一标记作为 原点。再以点样距扳子宽窄可点几个点同时 展开，点与点之间间隔12cm。a.可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注射器。注 意要等一个点干了再点另一个点。b.用一小直径3 mm 滤纸片，浸入样液，埋到 板子上先挖好一个小洞穴。59 展开：点样完了，放入密闭容器中（展开槽），倾斜一定角度1030，下端浸入展开剂1cm，千万别让溶剂浸过了样点。到离顶端一部分，取出样板、晾干、显色。a.展开剂的有关情况：主要是低沸点的23种有机溶剂组成的溶剂系统，分离效果主要决定于展开剂的选择，因为吸附剂在一定情况下是恒定的，吸附剂的选择余地远远小于展开剂的选择。60b.展开剂的选择方法：.微量圆环法。.用小载波片试验，微量展开剂展开5cm。.图解法：样品极性小，选吸附剂活性高，展开剂极性低的。样品极性大，选吸附剂活性低，展开剂极性高。 有机溶剂极性由小到大为： 石油醚、环己烷、四氯化碳、三氯乙烷、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、正丙醇、乙醇、甲醇、水、吡啶、有机酸类等。61c.展开的方式：上行法、下行法、双向展开、单向多次