铁皮石斛的组织培养与快速繁殖

1、铁皮石斛的组织培养与快速繁殖摘要：实验以铁皮石斛优良品种的茎段为外殖体，诱导丛生芽，壮苗生根，从而实现大量繁 殖。当NAA的浓度为0.3mg/L, 6-BA的浓度为5mg/L时，铁皮石斛丛生芽的增殖率最高。 在MS培养基中，铁皮石斛壮苗生根的最好培养基为MS + 6 - BA （ 2mg/L ） + 20 %香蕉汁。不同激素浓度的6-BA对铁皮石斛壮苗生根的影响比较得出，不加6-BA的培养基小苗生根 率低、发根迟、根数少；而加A6-BA后以大幅度提高生根率，尤以在6-BA 0.4mg/L的培养 基中小苗生根快，根数多。从不同培养基对铁皮石斛试管苗生长的影响看出，幼苗用MS培 养基比用KC培养基

2、培养生长好。铁皮石斛培养60d左右时生长速度最快。香蕉提取液能 促进生长，从而使苗的生长加快。以MS +香蕉汁20 %的培养基为最好。关键词：铁皮石斛；组织培养；丛生芽；壮苗生根铁皮石斛是兰科著名的盆载观花植物，具有很高的观赏价值。近年来，铁皮石斛培养及快速 繁殖技术的研究，取得了很大的成果。本实验对药用铁皮石斛茎段进行组织培养，提出了一 套快速繁殖程序，为快速育苗提供了有价值的技术资料和科学依据。利用组织培养技术，对 药用铁皮石斛进行快速繁殖，是目前解决生产种苗问题的有效方法。1材料与方法1.1试验材料铁皮石斛优良品种，来源于日本。1.2 试验方法1.2.1外植体的选取和预处理将从日本引进的

3、生长旺盛的铁皮石斛健康植株，以茎芽为中心剪下，芽的上下各留0.5cm的 茎段，用洗衣粉浸泡20min左右，取出后再用自来水反复冲洗数次，备用。1.2.2外植体的灭菌将预处理过的外植体用75 %的酒精溶液灭菌30 s，然后用无菌水冲洗l次，将茎段腋芽的 苞叶拨去，然后将0.1 %的HgC12溶液倒人烧杯中灭菌10 min，灭菌过程中不断摇动烧杯 使灭菌更加彻底，最后用无菌水冲洗5、6次将HgCl2溶液冲净并接种到培养基上。1.2.3培 养基的灭菌将三角瓶用玻璃纸包好，作好标记。待琼脂冷凝后放入高压灭菌锅中灭菌（121 C、15min ）。 冷却后可放人培养室预培养3d，没有杂菌污染则可取铁皮石斛

4、材料进行接种。1.2.4组织培养室的条件所有材料均在组织培养室中培养，温度为22 C，每天光照12h，光照强度为2O00lx。2结果与分析2.1不同基础培养基对铁皮石斛生长的影响对试管移栽苗来说，苗长势的好坏、壮、弱，直 接影响到移苗的成活率。为此，本实验设计了 MS , 1/2MS , KC , 1/2KC基础培养基对铁皮石 斛壮苗生长的影响，其结果见表2。从表2中可以看出：幼苗用MS培养基比用KC培养基培养生长好。香蕉提取液能促进根 系生长，从而使苗的生长加快。为促进幼苗生长，培养基中需添加较高浓度的香蕉提取液。 而以MS的培养基为最好，A级比率占84 %2.2不同添加物对铁皮石斛壮苗生根

5、的影响为了探寻铁皮石斛无根苗生根壮苗的合适培养 基，设置以下不同处理（表2 ）诱导生根培养基，用MS加NAA 2mg/L, pH为5.6。将大 小达3 - 4cm的无根苗切割成单苗，接种于5种不同处理生根培养基上，每种培养基接种 20株，培养28d后统计结果。从表2中可以看出：在壮苗生根培养基中，在对照（处理5 ）中，既添加2mg/L的NAA可 以使25 %无根苗长出根；在添加了香蕉之后（处理l ）效果明显，生根率达到95 %，而且 每株苗平均有4.5条根，且组培苗健壮，根系粗壮，表明香蕉汁对铁皮石斛生根壮苗有显著 促进作用。2.3铁皮石斛生长的最佳时间将带有一个芽的铁皮石斛茎段接种于已经确定

6、的最适基础培养基（MS +香蕉汁20 % ）上， 在温度为22 C，每天光照12h，光照强度为2000h的条件下培养，分别于30d、45d、 60d和80d统计诱导产生的丛生芽数。由表3可以看出当培养3Od是已经有明显的变化芽增殖数为15。随着培养时间的增长芽 的增殖数不断增加。10d左右带有一个芽的铁皮石斛茎段开始有明显的变化。随着时间的增 长逐渐有新的小芽长出，有的长成膨大芽。3Od时芽增殖数已经达15个。当生长到6Od时 达到铁皮石斛的最高生长点。以后铁皮石斛的生长趋于平缓的生长。2.4激素对铁皮石斛丛生芽增殖的影响NAA浓度对铁皮石料丛生芽增殖的影响将6-BA的浓度定为5mg/L，向培

7、养基（每种 培养基中均加人20 %的香蕉汁）中加入0.2,0.3,0.4 （ mg/L ）浓度的NAA，将带有一个 芽的铁皮石斛茎段接种于培养基上，每个梯度的外殖体数定为20，在温度为22 C，每天 光照12h，光照强度为ZOO0h的条件下，培养60d，统计丛生芽，进行梯度的筛选。由 表4可以看出在6 - BA浓度为5mg/L及添加物不变的情况下，当NAA的浓度为0.3mg/L 时平均增长的芽数最多为5.4。由此可见当NAA的浓度为0.3mg/L, 6-BA浓度为5mg/L时， 铁皮石斛丛生芽的增殖率最高。6 - BA浓度对铁皮石斛丛生芽增殖的影响将NAA的浓度定为0.3 mg/L，向MS培养

8、基（每种培养基中均加人20 %的香蕉汁）中 分别加人4,5,6 （ mg/L ）浓度的6-BA。将带有一个芽的茎段接种于培养基（每种培养基 中均加入20 %的香蕉汁）上，在温度为22 C，每天光照12h，光照强度为2 00Olx的 条件下，培养60d，统计铁皮石斛丛生芽数。由表5可以看出在NAA浓度0.3mg/L及添加物不变的情况下，当6 - BA的浓度为5mg/L时 平均增长的芽数最多为5.4。由此可见当6-BA的浓度为5 mg/L, NAA的浓度为0.3mg/L时， 铁皮石斛丛生芽的增殖率最高。2.5壮苗与生根当茎段产生的小苗长成1 一 2 cm高，并分化出1 一 2片叶片时，将小苗接种在

9、小苗培养 基中，接种60d后记录生根情况。无根小苗在接种2Od后开始出现根的分化，在茎基部或节上出现浅黄绿色的突起，尖端的 颜色较浅，长度约1 mm，直径约0.8 mm。接种约60d后，各处理组的根的诱导率在4 % 一 60 %之间。平均根长可达2 3 cm，平均根直径可达0.2 一 0.4 cm，各处理组中平 均根数最高可达6.33条/株，最多单株根条数达9条。根为浅绿色，在培养基中的吸收根 表面光滑。一些小苗长出较长的气生根，暴露于空气中，气生根与吸收根的最大不同点在于 其表面有成片分布的白色茸毛组成的根被，由根尖之后0.5 cm开始延伸到根的近茎端。气 生根最高可达4.56 cm，直径0

10、.5 cm，叶片增大，呈长椭圆形，叶色由浅绿变为深绿，叶 片变厚，有的品种叶片背面呈红色，尤其是叶背边缘的红色较明显。继续培养30 一 60d， 根的诱导率继续提高，最高可达90 %。叶片长度可达5 8 cm，小苗高3 7 cm，每 株叶片2 一 5片。根的诱导率和生长状况，在不同浓度6-BA与NAA配比的培养基中的差 异很大。试验结果表明NAA浓度为0.1 mg / L时，随6-BA浓度的提高，根的诱导率先升后 降，在6-BA 2.0 + NAA 0.1组中诱导率可达60 %。当6-BA浓度达到3mg/L时诱导率急剧 下降，仅为5.00 %NAA 0.1组的平均根数和平均根长均随6-BA浓度

11、升高而降低。在NAA浓 度为0.3 mg / L时，各6-BA浓度的根诱导率和平均根数差异不大，诱导率总体水平较NAA 0.1和NAA 0.5组高，平均根数较NAA 0.1组高。平均根长随6-BA浓度提高而增加。在6-BA 3.0十NAA 0.3组中，平均根长达到最大值1.58 cm。在NAA浓度提到到0.5mg/L时，诱 导率反而下降，平均根数除6-BA 2.0 + NAA 0.5组为全部组别中的最大值4.33夕卜，其余处理 组平均根数比NAA浓度0.3mg/L和0.lmg/L时低，平均根长与NAA浓度没有明显的相关 性。从表7中实验结果可以看出，添加不同浓度、不同比例的NAA与6-BA对铁

12、皮石斛幼苗生 根壮苗具有不同的影响。3讨论3.1铁皮石斛快速繁殖受基本培养基、添加物和植物激素的影响铁皮石斛采用蔗糖浓度3 % , pH值5.6固体培养基培养。培养基常用MS , 1/2MS , KC (Knudson ) , 1/2KC ；激素种类有NAA , 6-BA ；附加物为马铃薯汁、椰乳汁、黄瓜汁、香蕉 汁等。在进行铁皮石斛培养时，要根据培养材料与培养目的物的不同，选用不同的培养基、 激素和添加物种类。本实验选用的是MS培养基，所用的添加物为20 %香蕉汁。3.2 组培苗生长幼苗用MS培养基比用KC培养基培养生长好。NAA、香蕉和马铃薯提取液能促进根系生 长，从而使试管苗的生长加快。

13、试验中我们常采用MS为基本培养基，添加香蕉提取液和 NAA培养试管苗。幼苗必须在试管中充分生长，达到一定大小才能出管移栽，这即为壮苗培养。在这个阶段中， 为使幼苗各种代谢机能比较稳定，所应用培养基应该以比较简单为宜，而且培养基离子浓度 不能太高，离子浓度太高易引起幼苗生长停滞或畸形，成为僵苗或畸形苗。3.3丛生芽的增殖将带有一个芽的铁皮石斛茎段接种于MS培养基(每种培养基中均加人20 %的香蕉汁)上， 每个梯度的外殖体数定为20，在温度为22 C，每天光照12h，光照强度为2 OO0lx的 条件下，培养60d后观察得6-BAS + NAA 0.3mg/L组铁皮石斛的丛生芽增殖率高。壮苗与生根将小苗接种到生根培养基中，20d左右小苗的茎节上开始出现根的分化，接种3Od后小苗 长出浅绿色长度0.8 一 1 cm、直径0.1 一 0.2 cm的小根，60d后根长度最长可达5 cm以 上。6-BA主要促进细胞的分裂、诱导芽的分化，而NAA主要促进生根，但是芽或根的分化 主要取决于细胞分裂素/生长素的比值。就根的诱导率而言，6-BA 2.Omg/L + NAA 0.1 mg / L 组最高，达到60 % , NAAO.3mg/L组诱导率也较高，在40 %以上，NAA浓度提高到0.5mg/L， 根的诱导率反而下降。就平均根数而言，NAA浓度在0.3mg/L