同济大学细胞生物学课件-细胞生物学的研究技术

1、第二章 细胞生物学的研究技术第一节 显微技术一、光学显微技术（一）光学显微镜技术 （二）光学显微制片技术二、电子显微技术第二节 细胞培养及细胞组分的分离技术一、细胞培养技术二、细胞器的分离与提纯技术三、细胞成分的分析技术第一节 显微技术一、光学显微技术（一）光学显微镜技术光源: 可见光等聚光镜、目镜、物镜分辨力，指人眼在25cm的明视距离处分辨物体结构最小间距的能力一般光镜的分辨力为0.39m，放大倍数可达1600倍光学显微镜类型普通光学显微镜相差显微镜暗视野显微镜荧光显微镜共焦点激光扫描显微镜普通光学显微镜 用于细胞一般形态结构的观察，如细胞核、核仁、细胞膜、线粒体、中心体、高尔基体、染色体

2、等相差显微镜环形光阑相板 通过改变光线的振幅差，提高细胞结构的对比度而提高分辨力。主要用于活体细胞的观察暗视野显微镜 特殊聚光器（遮光板），视野的背景是黑暗的，而被检物体为亮点荧光显微镜以紫外光作光源，激发标本中的荧光物质使其发射荧光叶绿体能自发产生红色荧光有些需经过荧光染料 如吖啶橙等染色才能DNA、RNA产生荧光（二）光学显微制片技术制片：血液、骨髓及表皮组织可直接涂片或铺片固体组织材料则需通过组织切片或压片石蜡包埋切片：组织材料经甲醛、戊二醛等固定剂固定，乙醇等脱水，石蜡包埋，切片染色如铁苏木精伊红(H.E)染色观察细胞形态结构硝酸根染色观察高尔基体铁苏木精染色观察于线粒体苏丹染料观察脂

3、肪滴其它方法细胞中酶的显示化学成分如DNA、RNA显示酶标记放射自显影胶体金标记二、电子显微技术德国科学家 Knolls和 Ruska 1932年发明电子显微镜电子束代替光线电磁场透镜代替玻璃透镜最大分辨力约为2nm，直接放大倍数可达80万倍左右电镜的分类透射式电镜(transmission electron microscope,TEM)扫描式电镜(scanning electron microscope, SEM)透射电镜观察细胞内部结构材料必须固定、脱水后用环氧树脂等包埋，超薄切片机切成50100nm的超薄片，并用硝酸铅、醋酸铀等染色电镜原理图电镜结构图扫描电镜电子枪发射的电子束形成电子

4、探针扫描，收集二次电子、转换后放大，在荧光屏上成像标本需干燥、镀金(使标本导电)用于细胞或组织材料的表面立体图像的观察分析扫描电镜外观扫描电镜照片电镜标本特殊处理负染色冰冻切片金属投影冷冻蚀刻放射自显影酶标记第二节 细胞培养及细胞组分的分离技术 一、细胞培养技术细胞培养：从多细胞生物的机体中用无菌操作的方法取出活体细胞，在体外模拟类似机体的温度、pH值、营养条件，使其继续生存、生长并进行传代繁殖的过程。原代培养与传代培养原代培养(primary culture)直接从体内获取组织细胞的首次培养。传代培养(subculture)从原代培养的细胞中分取一部分进行的扩大培养或再次培养。细胞株与细胞系

5、细胞株(Cell Strain) 细胞在传代培养中仍能保持正常的二倍体染色体数及接触抑制行为，成为细胞株细胞系(Cell Line) 细胞发生遗传改变，染色体出现非正倍体，细胞接触抑制消失，往往可无限传代 Hela细胞系细胞培养示意图二、细胞器的分离与提纯技术差速离心法低速(1000转/分)短时间(15分钟)离心可首先将较大的细胞核沉淀下来 高速(800025000转/分)离心可使次大的线粒体分离超速(2500085000转/分)离心，可收集溶酶体等封闭小泡以及核糖体。密度梯度离心以蔗糖、甘油、氯化铯作为介质离心时介质形成密度梯度不同大小的颗粒形成相应的密度带三、细胞成分的分析技术细胞原位分析方法通过特殊染色、标记，如孚尔根(Feulgen)反应是特异显示细胞内DNA存在部位的方法放射自显影(autoradiography)利用放射性同位素3H、32P 125I、14C等标记， 敷以感光乳胶，感光、显影后，通过光镜或电镜观察，可了解被标记物质的分布情况及含量。胶体金标记技术胶体金标记可用于光镜，透式电镜和扫描电镜层析蛋白质混合液通过含有多孔固体基质的柱，不同的蛋白质与基质相互作用而被不同程度的滞留，当其从柱底流出时，即可被分别收集。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS：十二烷基硫酸钠使蛋白质展开成为伸展的多肽链聚丙烯酰胺凝胶中电泳复杂的蛋白质混合物按分