生物信息学16s分析测序1

1、16s16S rRNA是编码原核生物核糖体小亚基的，长度约为1542bp，其分子大小适中，突变率小，是细菌系统分类学研究中最常用和最有用的标志。其序列包含可变区（Variable region）和保守区（constant region）。可变区序列因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关，通过提取环境样品的DNA，并扩增和检测其中的一段或几段区域，可以了解环境样品(土壤、肠道、海洋)中细菌的种类和丰度。OTU (operational taxonomic units)如果序列之间，比如不同的 16S rRNA序列的相似性高于97%就可以把它定义为一个OTU，每个 OTU对应于一个不同的1

2、6S rRNA序列，也就是每个OTU对应于一个不同的细菌（微生物）种。通过 OTU分析，就可以知道样品中的微生物多样性和不同微生物的丰度。区域由于16s rDNA较长（1.5kb），考虑到序。16s的读长限制，只能对可变区进rDNA包含有9个可变区，分别是v1-v9。一般我们对v3，v3-v4和v6可变区域进行扩增和。主要内容QIIME安装数据处理 OTU分析与注释 Venn图绘制 Heatmap图绘制样品复杂度分析 (Alpha diversity)多样品比较分析 (Beta diversity)系统树的构建其他分析Qiime的安装()Qiime的安装电脑为什么安装不了？Linux常见命令c

3、dpwdmkdir/touchlscpmvrmzip/tarhistorywgetshutdown/reboot切换到目录显示当前目录完整路径新建目录/文件查看文件与目录文件移动文件、目录或更名删除文件或目录解压缩文件查看历史命令命令行的关机/重启工具主要内容QIIME安装数据处理 OTU分析与注释 Venn图绘制 Heatmap图绘制样品复杂度分析 (Alpha diversity)多样品比较分析 (Beta diversity)系统树的构建其他分析FASTQ数据EBI ( SRA ()样品信息文件 (map.txt)1.第一列必须是#S应该是唯一的。leID，为可区分的数字，字母或 。每一

4、行的这个值2.3.4.第二列必须为BarcodeSequence。每一行的这个值应该是唯一的。第三列必须为LinkrimerSequence，为扩增样品的引物。后面的列可以根据样品的特点加以描述，但是每一列必须包含至少两个值，就是指定样品信息，就可以在这个位置设置了。最后一列必须是Description。每一个样品不一样的地方，必须不一样额。5.#SleIDBarcodeSequenceDescriptionLinkrimerSequenleTypeSRR1370913AGCTGACTAGTCGTGCCAGCMGCCGCGGTAAtumorSRR1370913SRR1370914AGCTGAC

5、TAGTGGTGCCAGCMGCCGCGGTAAtumorSRR1370914SRR1370915AGCTGACTAGTAGTGCCAGCMGCCGCGGTAAnormalSRR1370915SRR1370920AGCTGACTAGTTGTGCCAGCMGCCGCGGTAAnormalSRR1370920join_paired_ends.py (fastq-join)过滤 (split_libraries_fastq.py)convert to fastaRead too short after quality truncation N charactersOTU分析与注释-pick_open

6、_reference_otus.pypick_otus.py从fasta文件中提取OTUs，提取方法有cd-hit，blast，Mothur，usearch。make_otu_table.py将提取出的OTUs制作成out_table，即.biom文件。assign_taxonomy.py使用reference中的reference_seqs和 taxonomy文件对序列分类。biom add-metadata将taxa数据加入到.biom文件。Venn图Heatmap图主要内容QIIME安装数据处理 OTU分析与注释 Venn图绘制 Heatmap图绘制样品复杂度分析 (Alpha dive

7、rsity)多样品比较分析 (Beta diversity)系统树的构建其他分析core_diversity_yses.pysingle_rarefaction.py-Rarify the OTU tablebeta_diversity.pybeta多样性principal_coordinates.pyPCoA图形化alpha_diversity.pyAlpha多样性make_rarefaction_plots.py稀释曲线summarize_taxa.py-Summarize Taxonomyplot_taxa_summary.py-Taxa summary plotsAlpha多样性（样本

8、内多样性）Alpha多样性是指一个特定区域或者生态系统内的多样性，常用的度量指标有Chao1 丰富度估计量（Chao1 richnessestimator） 、多样性指数（Shannon diversity index）、多样性指数（Simpson diversity index）等。计算菌群丰度：Chao；计算菌群多样性：Shannon、Simpson。Chao1 丰富度估计量Chao1：是用chao1 算法估计群落中含OTU数目的指数，chao1 在生态学中常用来估计物种总数，由Chao (1984)最早提出。Chao1值越大代表物种总数越多。计算公式：Schao1=Sobs+n1(n1-

9、1)/2(n2+1)和多样性指数Shannon-Wiener 曲线，是利用shannon指数来进行绘制的，反映样品中微生物多样性的指数，利用各样品的量在不同深度时的微生物多样性指数构建曲线，以此反映各样本在不同数量时的微生物多样性。 当曲线趋向平坦时，说明数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物物种信息。Simpson：用来估算样品中微生物的多样性指数之一，在生态学中常用来定量的描述一个区域的生物多样性。Simpson指数值越大，说明群落多样性越高。R-Abundance曲线同时解释样品所含物种的丰富程度和均匀程度。横坐标代表物种排序的数 量；纵坐标代表观测到的 相对丰度。物种的丰富程 度

10、由曲线在横轴上的长度 来反映，曲线越宽，表示 物种的组成越丰富；物种 组成的均匀程度由曲线的 形状来反映，曲线越平坦，表示物种组成的均匀程度 越高。而曲线快速陡然下 降表明样本中的优势菌群 所占比例很高，多样性较 低。Beta多样性分析（样品间差异分析）Beta多样性是生态系之间的种多样性，它包含分的比较生态系内的每一独特性。即衡量群落之类间的差别。Beta多样性不仅描述生境内生物种类的数量，同时也考虑到这些种类的相同性及其彼此之间的位置。不同生境间或某一生态梯度上不同地段间生物种类的相似性越差，Beta生物多样性越高。PCoA(主坐标分析)PCoA分析，即主坐标分析（PCoA，Princip

11、alCoordinateysis）可以从复杂的度数据中提取和可视化展示主要的高信息量突变,与PCA的主要类似。它将距离矩阵的信息转变成在一系列直交轴中显示，这样某种变量的最大值体现在第一个成分坐标中，而另一种变量的最大值体现在另一个成分坐标上。距离越近的点代表样本间相似应该聚在一起。高，理论上生物学重复的样本unweighted unifrac对于系统发生树所有枝,考查其指向的叶节点是否只存于同一个群落,那些叶节点只存在于同一群落的枝的枝长和,占整个树的枝长和的比例,就定义为UniFrac距离。UniFrac计算了仅被一个群落占据的进化历史的相对大小,这个量越大,说明两个群落中独立的进化过程越

12、多,也就说明这两个群落的差别越大。若两个群落完全相同,那么它们没有各自独立的进化过程,UniFrac值为0;若两个群落在进化树中完全分开,即它们是完全独立的两个进化过程,那么UniFrac值为1.weighted unifracUniFrac的定义中,可以看出它只考虑序列是否在群落中出现,而不考虑序列的丰度。若两个群落包含的物种完全相同,那么不管每个物种的丰度是否有差别或者差别的大小，UniFrac值为0。但在某些具体的情况下,的恰恰是群落中物种丰度的变化,例如研研究者感肠道微生物分布在抗生素治疗下的变化情况,这究时UniFrac就不能解决问题了。weighted unifrac方法,就是在U

13、niFrac的基础上,将序列的丰度纳入考虑,它能够区分物种丰度的差别。主要内容QIIME安装数据处理 OTU分析与注释 Venn图绘制 Heatmap图绘制样品复杂度分析 (Alpha diversity)多样品比较分析 (Beta diversity)系统树的构建其他分析系统树系统发生树（英文：phylogenetic tree或 evolutionary tree）是表明被认为具有共同祖先的各物种相互间演化关系的树，又被称为系统发育树、系统 演化树、系统进化树、种系发生树、演化树、进化树、系统树。 它用来表示系统发生研究的结果，用它描述物种之间的进化关系。构建系统树主要步骤filter_otus_from_otu_table.py挑选丰度1的OTUfilter_fasta.py获得丰度1OTU的fasta文件make_phylogeny.py构建系统树ggtree.R系统树可视化系统树系统树差异OTU分析;OTUbaseMea nlog2Fo ldChan gespvaluepadjtaxonomy17876444