赛莱拉单细胞测序平台

1、单细胞测序技术发展史及各技术平台大比拼随着近几年的迅速发展，单细胞RNA测序技术已应用在多个领域，如：早期胚胎发育 到组织和器官发育、以及免疫学和肿瘤学。近两年有多项成果发表在Nature、Science 和Cell等顶级杂志上。2018年12月21日，Science杂志发布了 “2018年度突破” （BREAKTHROUGH OF THE YEAR）榜单，共计10项突破性成果入选，单细胞测序揭示胚胎发 育更是当选“2018年度突破”榜首，并预言单细胞技术将引领今后10年的生物医学研究。1.为什么做单细胞测序即使来源相同的单个细胞，由于随机生物过程和环境扰动的原因，彼此在许多方面也存 在差异，

2、即细胞的异质性。常见的基因组测序技术避免不了这一现象带来的影响，基于这一 原因，研究人员开启了单细胞测序技术的探索之路。单细胞测序技术可谓是生物科技发展史 上的一大创举。对于多细胞生物而言，其细胞与细胞之间存在着差异，且不同群体细胞间的差异不一。 这种差异不仅体现在形态上，也体现在遗传信息上，例如基因组信息、基因表达水平等。虽 然同一个体所有细胞均来自于同一个受精卵，理论上细胞间基因组是一致的，但是在细胞分 裂和分化过程中，由于内部随机生物过程和外部环境扰动的影响，会导致细胞DNA序列发 生改变，比较典型的例子是肿瘤细胞VS正常细胞、不同肿瘤细胞亚型（肿瘤异质性）（图1）。图1：肿瘤异质性在基

3、因表达层面上，不同的细胞也具有独特的转录组，例如心肌细胞和神经细胞，而即 便是那些看似相同的细胞集合，细胞之间的表达水平也存在巨大差异。而细胞间遗传物质的 差异会导致细胞的异质性。人类基因组计划（HGP）完成后，随着测序技术尤其是高通量测序技术的迅速发展，人 们对基因组变异/基因表达差异与表型之间关系的认识越来越深刻。然而传统的Bulk测序手 段是针对细胞集合进行测序，即所使用的材料是组织样本或一大群培养细胞，针对这类样本 的研究反映的是特定组织/细胞集合的平均水平，或者是特定组织/细胞集合的代表性信息， 而同一组织往往是由多种细胞类型构成，且单个细胞间表达的信息也千差万别，因此常规 Bulk

4、测序时单个细胞特异性的信息往往被掩盖，导致错失很多重要信息。随着现代生物学的发展，常规Bulk测序研究已经不能满足科研需求，2011年，Nature Methods将单细胞测序列为年度值得期待的技术之一；2013年1月，Science杂志将单 细胞测序列为年度最值得关注的六大领域榜首；2014年1月，Nature Methods将单细胞 测序列为2013年度最重要的方法学进展，并且指出刊登在Nature系列杂志上的单细胞测序文章在2013年出现了大爆发。因此单细胞测序正在成为科研热点。2018 年 12 月 21 日，Science杂志发布了 “2018 年度突破”（BREAKTHROUGH

5、OF THE YEAR）榜单，共计10项突破性成果入选，单细胞测序揭示胚胎发育更是当选笠018年度突 破”榜首。处于发育早期的斑马鱼胚胎。荧光标记了确定它们将成为的细胞类型的基因。（图片来自Science）2.单细胞RNA测序发展历程单细胞测序可以分为单细胞DNA测序（单细胞基因组测序）和单细胞RNA测序（单细 胞转录组测序），细胞是生命活动的基本单位，1个细胞中含有的RNA只有1-10pg，这么少 的量远远达不到现有测序仪的最低上样需求，因此对于单细胞RNA测序，首先要解决的问 题是RNA扩增。1990年，Norman Iscove课题组，使用PCR技术实现了对cDNA分子的指数级扩增，首

6、次证实对单细胞进行转录组分析是可行的。20世纪90年代初期，Eberwine等人发明了一种新技术，能够从单个活神经元细胞中获 得cDNA，并且再以这些cDNA为模板转录生成RNA，实现RNA的线性扩增。2008年发展出了高通量RNA测序技术（二代测序），随后科研人员将高通量测序技术与之前发展起来的核酸扩增技术结合起来，对单细胞转录组进行了更加精细的研究。最早出现 的单细胞RNA扩增方法结合二代测序方出现在2009年，即Tang s method。Mulm 田tKiig吨inodr知 letsiromro(K3Crop-EeqiooMulm 田tKiig吨inodr知 letsiromro(K3

7、Crop-EeqiooroooUqLid M-ardlng10.0001WQ匚ytoS% ：单细胞转录组测序发展过程，图片来自 Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the last decadeco-Ji rtcgrndcd Fluid ItWrnr5SPLiT-SmjTang通过对单个小鼠卵裂细胞的研究发现，与芯片技术相比，利用单细胞转录组技术 可以多发现数千个基因的表达情况。之后，许多新颖的技术被开发出来，可以更快速、低成 本地提供更多信息。Quartz-Seq实际上是对Tang的方法进行了优化，简化了实验流程，进 一步减少了扩增副产

8、物的产生。CEL-seq技术于2012年发表在Cell Reports上，由以色 列理工学院的研究人员开发，CEL-seq是用体外转录代替PCR达到扩增的目的。2014年Science杂志发布的MARS-seq10与CEL-seq很类似。Smart-Seq是一项具里程碑意义的 技术，2012年由美国和瑞典的科学家共同开发。Smart-Seq和Smart-Seq2是基于SMART技 术(Switching Mechanism at 5 End of RNA Template)对目标RNA 进行扩增、测序，而且已 经有了较为成熟的商品化试剂盒，是目前应用较多的手段。随着单细胞RNA测序应用的深入和

9、细化，常常需要对复杂器官开展单细胞测序，单纯 对几个细胞做测序不再满足科研需求，需要一次性对几千甚至几万个细胞同时进行测序，分 析细胞间的基因表达差异，因此需要开发大规模低成本的单细胞测序方法。于是哈佛大学两 个团队将微流体技术与单细胞RNA-Seq结合，分别开发出Drop-seq和inDROP两种技术，并 在2015年发表在同一期的Cell杂志上。这两种技术都利用微流体装置生成液滴，液滴沿 着一根极细槽道流动时将带有条形码的微珠和细胞一起包裹进液滴，在液滴中实现反转录 扩增建库，同时每个条形码附着到每个细胞的基因上，因此可以一次测定所有的基因并追踪 每个基因的来源细胞。这些技术的出现，让快速

10、、低成本地分析数千个单细胞的基因活性成 为现实。表1：单细胞RNA测序技术总览MeehlsCaptured R时ecDNA coiTrageAmplifizatlcn cefhntiDvUMI SrrandspecificEarlyMultiplexingIfeim叩nlymerPTRpolvAk RMAsFid LlenRch with PCR after polvA tailnNd NoNobiaedQmrtz-polyA+FiiL-leiigch with -PCR after pnlyA caiLEngNe N-dNoseqbiased5C-seqpalyARMAsFull Lengt

11、h with 3-PCR polvA ailingNo 阮NobusedpolyA * and poly AFLiLLcngchPC R aftc r Dly-d ta ill ngN-o NoMoKM AS-polyA, andpolyAFLillenHch?CR itterpoly-tJC tailingYes Yes袍RNAsSwiRhinE顽甬PCESTRT stqpolvA+ EH拈5; tae (T55Jlemplacf swtehins-baied PCRYe s YesYesSma rt- setpolyA * RMAsFLil-lcngch with weak3-Jcmpla

12、c-c switching-based PCRMe NNobiased5rt-polyA RMAsMearty Full-lengthTemplate swbzhing-baied PCRNa NoNoDinp-scqpolyARNAs3, rag ： UTR)Icmplacc swtehing-based K.RYes YesFaELh-seqpDlyA + RIWMearly full-tengLhlemplac-e s.wtching-baieil PCRNj 汕51 tafTSS：-Yes YYesin vitro traoscription-based linear amplific

13、ationCEbsecpolyA KNAS3 Mgtunqtn vtm rranicnpnonY&Yes.CEL-seqZpolyA RKAsm vitro- crjmcripiLion and random primer Yes YesYeshgd PCRMARS-seqpolyA+ RKAs3 tag tUTR)irt viciv transcriptionYe s YestsLn DropspolyA1 KNA5y rag (UTK)m rttro iranscrlpELonYes YesYtsNt*由此tl pHmtfWbdwtl Pt RDP-seqpolyA明处SpeciiEicF

14、Ei anPCR u3designcd heptdnier primEsr-Nc 险Necyro-seqpolyA KMHS3 HE tin-R)gene-speo ric ptmers based pcrYes hoYesMALBApolvA4- RfJAsFiil-lenRchQu asi! id er PCR .sith 7 randorn MAL3ACNd NdNoRNAprimers3.三大单细胞测序策略比较越来越多的单细胞RNA测序平台被应用于科研和临床。目前最广泛使用的三种细胞捕 获策略是基于微孔(microwell)、微流控(microfuidic)和液滴(droplet)的方

15、法。基于微孔(microwell)的平台，如SMART-seq2、MARS-seq，使用例如移液管或激光捕 获分离细胞并将其置于微孔中，使基于表面标记选择细胞成为可能。这种方法的主要缺点是 它们通常是低通量的，每个细胞所需的工作量可能相当大。基于微流控(microfuidic)的平台，如Fluidigm C1，为捕获细胞和进行文库制备所需的 反应提供了一个更加集成的系统。因此，它们比基于微孔的平台提供更高的通量。通常情况 下，在微流控平台中只有大约10%细胞被捕获到，因此如果处理罕见的细胞类型或非常少量 的细胞，它们是不合适的。基于液滴(droplet)的平台，如10X Chromium Co

16、ntroller，利用微流控技术进行单个细 胞分选，将带有条形码和引物的凝胶珠和单个细胞包裹在油滴中；在每个油滴内，凝胶珠溶 解，细胞裂解释放mRNA，通过逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA；液体油层破坏后， cDNA后续进行文库构建，使用Illumina测序平台对文库进行测序检测，即可一次性获得大 量单细胞的基因表达数据，10min内自动完成多至80,000个细胞的捕获，从而实现在单细 胞水平进行表达测序的目的。10X Chromium Single Cell Gene Expression Solution 技术原理与其他高通量捕获平台相比，10X Chromium Controlle

17、r具有多方面的优势，如：平台一 次实验可完成多至80,000个细胞的捕获，通量高、周期快速，成本最低、细胞捕获效率高， 单个样本细胞捕获率高达65%；商业化仪器操作简便等。Tsihle IRNA qiLetK-in mclhfwkMethodFlitdlpn Cl(SMART-M)iFl uM (gm Cl syNtim (mRNA Stq HT)SMART-se|仙丽Fluidigm Cl -Hutdigm Cl nFACS1QX (jicnqniicx Chrurnium single cell C4jntnMlrTFACSCdlsizeILomuaenDLis si 趺 of 5- l(

18、HM 1017 心1 I Q.MIO 10,000Nu liiriiuuiun 20.000No limilitiQnV 传回 1 quulitj con iroll checkMicroscope cniinaLionMicroscope exam indl km.NdNoNo-Liufi点 Germ storageNo. FT1U3I pioccss immediaEelyNs must prnccKB immediatelyYesNtih must process iirimdiMidyYesTJirMiihputLimited by :number of machinesLimiEed by number ci rnuchinesLimited 町 cipmrtor cfficicrKyUp Ki 8 samples ptr chipFukcss is wuwimccdCwi+ + + + + + + + 3 days-7 we*Sample Prep