蛋白质定性定量分析

1、关于蛋白质的定性定量分析第一张，PPT共五十九页，创作于2022年6月 蛋白质定性分析 (qualitative analysis) 确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是何种蛋白质 蛋白质定量分析 (quantitative analysis) 确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白成分的含量第二张，PPT共五十九页，创作于2022年6月 蛋白质含量的测定方法（重点掌握） 蛋白质相对分子量测定 (SDS) 等电聚焦电泳 (IEF)（一般了解） 蛋白质的免疫印迹分析 (western blot)第三张，PPT共五十九页，创作于2022年6月第一章 蛋白质的含量测定蛋白质的含量测定基于蛋白质的

2、元素组成特点基于蛋白质的化学显色反应基于蛋白质的光吸收特性第四张，PPT共五十九页，创作于2022年6月 蛋白质元素组成的特点各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16 由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数 6.251001/16%第五张，PPT共五十九页，创作于2022年6月一、紫外光谱 (A280)吸收法 这一方法可用来快速检测溶液中是否含有蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋白质的洗脱峰第六张，PPT共五十九页，创作于2022年6月原 理 色氨酸、酪氨酸的最大

3、吸收峰在280 nm附近 大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280 nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法芳香族氨基酸的紫外吸收第七张，PPT共五十九页，创作于2022年6月优 点 快速缺 点 核酸可引起强干扰作用芳香族氨基酸含量差异可以起误差 对蛋白质无破坏性 不是严格的定量，适用于测定蛋 白质粗提液 第八张，PPT共五十九页，创作于2022年6月计算方法 标准曲线法 蛋白质浓度 (mg/ml) =1.45A280-0.74A260注意事项 石英比色杯 调零所用溶液 配制标准蛋白所用溶液 光密度范围第九张，PPT共五十九页，创作于2022年6月二、考马斯亮蓝G

4、-250检测法 这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质含量的方法第十张，PPT共五十九页，创作于2022年6月原 理 该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物在595 mn波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测595 mn的光吸收值大小计算蛋白的含量第十一张，PPT共五十九页，创作于2022年6月所需时间 10 min优 点 快速（反应时间仅需2 min） 敏感，几乎没有蛋白质损失缺 点 用这种测定方法对蛋白质引起不 可逆的变性 对各种纯化

5、蛋白质反应不同第十二张，PPT共五十九页，创作于2022年6月计算方法 标准曲线法注意事项 反应1015 min后开始出现沉淀， 尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条 件下易发生沉淀 若选用目的蛋白来做标准曲线或用 另一种方法来校正，所测蛋白浓度 较准确第十三张，PPT共五十九页，创作于2022年6月三、Lowry检测法 这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已得到广泛应用.第十四张，PPT共五十九页，创作于2022年6月原 理 首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin-酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的复合物在745 750 nm处有最大的

6、吸收峰，颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比，可根据750 nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量第十五张，PPT共五十九页，创作于2022年6月优 点 一种可靠的蛋白质定量方法 不同蛋白质之间差别很小缺 点 某些试剂不稳定 干扰物质多 使蛋白质发生不可逆变性第十六张，PPT共五十九页，创作于2022年6月计算方法 标准曲线法注意事项 在加入试剂30 min后呈色达到饱 和，时间延长颜色信号减弱 许多干扰物质降低颜色反应 高盐浓度可引起沉淀第十七张，PPT共五十九页，创作于2022年6月四、BCA (二喹啉甲酸)检测法 这是近年来新研制的一种改进的Lowry测定法第十八张，PPT共五十九页，创作

7、于2022年6月原 理 在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu2生成络合物，同时将Cu2还原成Cu。而BCA试剂可敏感特异地与Cu结合，形成稳定的有颜色的复合物，在562 nm处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量第十九张，PPT共五十九页，创作于2022年6月优 点 检测敏感性高缺 点 蛋白质发生不可逆的变性 终产物稳定巯基试剂和去垢剂干扰第二十张，PPT共五十九页，创作于2022年6月第二节 蛋白质相对分子量测定分子量测定 (molecular weight, MW)排阻层析沉降平衡超速离心动态弹性光散射孔径梯度电泳质谱 (ESI-MS)第二十

8、一张，PPT共五十九页，创作于2022年6月一、SDS测定蛋白质的相对分子量1. 不连续系统原理2. SDS凝胶的制备制备分离胶制备浓缩胶加样装板电泳卸板并进行凝胶染色第二十二张，PPT共五十九页，创作于2022年6月3. SDS基本原理 SDS 影响迁移率的因素 十二烷基硫酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfate) 十二烷基磺酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfonate ) 第二十三张，PPT共五十九页，创作于2022年6月 SDS作用：与蛋白牢固结合，当其浓度大于1 mmol/L 时，SDS与蛋白质的结合比例为 1.4g SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电

9、荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异第二十四张，PPT共五十九页，创作于2022年6月 SDS-蛋白质复合物分子构型也几乎相同(雪茄烟形的长椭圆棒状的复合物)，而且具有相同的荷质比，因此在SDS中，SDS-蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子量有关，而不再受所带电荷及分子形状的影响，且在一定条件下，迁移率与分子量呈对数线性关系 Watch SDS原理第二十五张，PPT共五十九页，创作于2022年6月4. SDS测定分子量的操作 标准品的选择及处理 待测样品的制备 电泳分离及染色 相对迁移率的计算Watch SDS操作第

10、二十六张，PPT共五十九页，创作于2022年6月Analysis for SDSelectrophoresis第二十七张，PPT共五十九页，创作于2022年6月5. 注意事项 选择合适的胶浓度 样品中高浓度的阳离子可能会导致SDS的沉 淀，应在加入样品缓冲液之前将其除去 SDS与蛋白质之间的结合程度 蛋白质的分子量范围 15200 KD之间 二硫键是否完全被还原 溶液中SDS的浓度 溶液的离子强度第二十八张，PPT共五十九页，创作于2022年6月 多亚基蛋白质分子量检测 用其它方法测定分子量进行参照 SDS和巯基乙醇 SDS测定的准确性 电荷异常或构象异常 带有较大辅基的蛋白质 某些结构蛋白第

11、二十九张，PPT共五十九页，创作于2022年6月二、凝胶过滤层析测定蛋白质的相对分子量1. 基本原理2. 凝胶过滤测定分子量的操作 分子筛效应 洗脱体积与相应分子量的关系装柱平衡加样平衡洗脱收集样品并计算Ve绘制标准曲线第三十张，PPT共五十九页，创作于2022年6月第三十一张，PPT共五十九页，创作于2022年6月3. 注意事项 柱床表面不能干燥 凝胶的选择 Sephadex 溶胀 G值的意义 凝胶柱的再生与保存第三十二张，PPT共五十九页，创作于2022年6月第 三 节 等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点第三十三张，PPT共五十九页，创作于2022年6月等电点 (isoelectric poi

12、nt, pI)两性电解质性质支持介质 (supporting media)Figure of IEF第三十四张，PPT共五十九页，创作于2022年6月+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10Isoelectric Focusing第三十五张，PPT共五十九页，创作于2022年6月ReadyStripTM IPG Strips310473658710310NL3.95.14.75.95.5-6.76.3-8.3High-purity monomersNarrow ranges for resolution o

13、f low-abundance proteinsOverlapping gradients for “cyber gels”Three lengths 7 cm, 11 cm and 17 cm 0.5 mm x 3.3 mm第三十六张，PPT共五十九页，创作于2022年6月Broad RangepH 3-10Narrow RangepH 4-7Micro RangepH 4.7-5.931044774.75.94.75.9第三十七张，PPT共五十九页，创作于2022年6月注意事项 两性电解质的选择 电极缓冲液 对样品的要求 样品必须无盐 加样的量要适当 加样方法 加样位置第三十八张，PPT共

14、五十九页，创作于2022年6月第四节 蛋白质的免疫印迹分析第三十九张，PPT共五十九页，创作于2022年6月 印迹技术 (blotting)是指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术 1975年，Edwen Southern提出了分子印迹(渍)的概念 目前这种技术已被广泛用于DNA、RNA和蛋白质的检测第四十张，PPT共五十九页，创作于2022年6月印迹技术的类别及应用 DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析 RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析 蛋

15、白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究 由于蛋白质常用抗体来检测，因此也被称为 免疫印迹技术 (immunoblotting)第四十一张，PPT共五十九页，创作于2022年6月一、免疫印迹分析的应用 对蛋白质进行定性分析 对蛋白质进行半定量分析 信号转导分析生物大分子相互作用分析第四十二张，PPT共五十九页，创作于2022年6月将蛋白质固定在膜上的其他应用 结构域分析 斑点印迹 抗体纯化 为制备抗体时获得相应的蛋白质抗原 蛋白质鉴定：氨基酸组成分析和序列分析第四十三张，PPT共五十九页，创作于2022年6月二、免疫印迹分析的基本流程 电泳分离蛋白

16、 转移至固相膜 封闭非特异结合位点 与第一抗体温育反应 与第二抗体交联物温育反应 显色制备蛋白样品蛋白质转移抗体检测第四十四张，PPT共五十九页，创作于2022年6月免疫印迹操作流程图第四十五张，PPT共五十九页，创作于2022年6月1. 样品的制备 组织或细胞中提取 裂解 去污剂 (SDS、Triton X-100、NP-40、Tween-20) 蛋白酶抑制剂 (PMSF、EDTA、Pepstatin、 Leupeptin、Aprotinin) 蛋白质的定量 (Bradford、BCA、Lowry) 基因工程表达重组产物第四十六张，PPT共五十九页，创作于2022年6月2. 电泳分离 SDS

17、 非变性PAGE EIF第四十七张，PPT共五十九页，创作于2022年6月3. 蛋白质的电转移方法：半干法、湿法 作用：将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上 注意：在叠放硝酸纤维素膜、聚丙烯酰胺凝胶时，膜与胶之间要紧密贴在一起，中间不能有任何气泡 ！？第四十八张，PPT共五十九页，创作于2022年6月常用的蛋白质转移膜种类 微孔大小 结合能力 特点NC膜0.45 um80-100 ug/cm2应用广泛 20kD易丢失PVDF膜0.22 um0.45 um80-100 ug/cm2170-200 ug/cm2 20kD不易丢失容量大、强度高尼龙膜480 ug/cm2用于核酸第四十九张，PPT共五

18、十九页，创作于2022年6月电转移装置第五十张，PPT共五十九页，创作于2022年6月电转移示意图第五十一张，PPT共五十九页，创作于2022年6月电转移装置第五十二张，PPT共五十九页，创作于2022年6月4. 靶蛋白的免疫学检测 封闭 对转移膜上的潜在结合位点进行封闭 ，防止抗体非特异性结合在膜上，降低背景颜色BSA、脱脂奶粉 第五十三张，PPT共五十九页，创作于2022年6月第五十四张，PPT共五十九页，创作于2022年6月 靶蛋白与第一抗体反应 单抗、多抗 注意：设立阳性对照和阴性对照，阴性对照可用免疫前血清、非相关单克隆抗体；阳性对照可用已知靶蛋白等 作用：排除假象第五十五张，PPT共五十九页，创作于2022年6月 与第二抗体反应 第二抗体一般是针对第一抗体的免疫球蛋白，可用同位素或非同位素物质进行标记 酶标抗体常用酶：碱性磷酸酶( alkaline phosphatase，AKP ) 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)胶体金标记、125I标记标记第五十六张，PPT共五十九页，创作于2022年6月 显色 AKP可催化底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷