猪瘟兔化弱毒细胞苗生产工艺

1、猪瘟兔化弱毒细胞苗生产工艺（内蒙古通辽岳泰集团付海江028000）一、 细胞培养1、 制苗用细胞牛睾丸细胞或羊肾细胞。2、 生长培养液目前的细胞培养液为乳汉（欧）液，或MEM10%新生牛血清+1%双抗（青/链霉素），pH7.07.2左右。3、 维持液目前的维持液为乳汉（欧）液，或MEM25%新生牛血清+1%双抗（青/链霉素），pH7.47.6。4、 细胞生长良好的几个注意事项1）制苗用细胞应选用非猪瘟疫区，无口蹄疫、粘膜病等传染病地区的14日龄健康小公牛或10日龄以内的健康羔羊。其家H健康生长的2）培养基和血清的质量可靠、稳定。应确保无外源病毒、支原体、细菌等污染，无牛病毒性腹泻病毒（BVDV

2、）及其抗体。用于生产猪瘟细胞苗的牛血清都要事先检测有无BVDV中和抗体的存在。3）制备原代牛睾丸细胞时，防止细胞消化过度。4）合适、营养丰富的细胞培养基。丰富的营养成分对细胞的生长、带毒状态维持和毒价的提高有直接影响。5）转瓶的洗涤应遵循严格的清洗程序。转瓶洗涤不干净，容易导致细胞不贴壁生长。二、 病毒感染、维持和收获生产用毒种有脾毒和细胞毒，脾毒是用选择定型热反应兔脾脏冷冻或冻干保存制备的；细胞毒是将用新鲜脾毒制成0.3%0.5%的病毒悬液接种生长良好的牛睾丸细胞或羊肾单层细胞，取二收、三收的细胞培养液作为生产用毒种。脾毒应选择兔体反应在36小时之前，同时防止脾毒采集过程的污染。该病毒不产生

3、细胞病变效应(CPE)，可连续多次收液。取已形成良好单层的牛睾丸细胞（或羊肾细胞），弃去培养液，接种含3%5%细胞毒种或0.2%0.3%脾毒种的维持液。接毒后4或5日第一次收获换液，以后每46日收获换液1次，可连续1215收左右，有的厂家可收更多。一般来说，1215收前的毒价合格率高，疫苗质量好。接毒时，细胞生长状态的好坏影响细胞产毒。也可对细胞带毒分散，分散比率1：4左右，可增加收次和产量。将检验合格的病毒培养液和5%蔗糖脱脂牛奶稳定剂按一定比例混合，分装，进行冻干。三、 病毒特征1、 猪瘟病毒（HCV）感染细胞超薄切片的电子显微镜观察表明，该病毒颗粒在膜结合的胞浆内空胞中装配并成熟，然后经

4、胞外释放。2、 56处理60分钟或6010分钟可灭活细胞培养液中的HCV。HCV在pH510时稳定，pH5.2时最适宜生长，但在低于pH4或高于pH11时快速灭活。3、 猪瘟病毒的抗原性和血清学与牛粘膜/病毒性腹泻病毒(MD/BVDV)密切相关，两者同源性很高，能互相诱导一定程度的同源病毒抗体，细胞或培养液中若存在牛病毒性腹泻病毒(BVDV)及其抗体，可与猪瘟病毒发生中和反应，造成疫苗生产的失败。四、 病毒收获液毒价不高的可能原因如果病毒收获液毒价不高，即病毒家兔感染量（RID）较低，制成的疫苗易造成免疫失败。猪瘟疫苗生产中毒价不高的可能原因：1）细胞培养液（乳汉液）营养不足，尤其是使用高压灭

5、菌液，高温可使一些营养成分损失，造成细胞生长状态不良；2）细胞培养液较多存在外源病毒，尤其是牛病毒性腹泻病毒（BVDV）会直接造成病毒滴度降低；3）成熟释放的病毒在维持液中耐受性较差，造成病毒滴度较低；4）病毒毒种毒力较低，并在传代过程中弱化。旧规程要求每1 ml病毒原液含病毒50,000个家兔感染量（RID）方可配苗，现要求提高至每1 ml含病毒500,000个家兔感染量。所以，提高疫苗单位毫升病毒量是提高疫苗质量的关键，进行猪瘟疫苗生产工艺的改进或者浓缩疫苗，显得非常必要、急迫。【附】：用不同剂量的C株苗免疫猪，证实免疫剂量与保护水平密切相关。我国猪瘟细胞苗出厂检验以5万倍稀释能致兔体热反

6、应为合格，即每毫升原液含5万RID。规定的免疫剂量为150RID（37PD50）。剂量不足时，攻毒后不能阻止强毒在体内复制和带毒。免疫剂量提高到80100PD50（约320400RID），攻毒后能制止亚临床感染，所有耐过猪均不带毒。目前欧洲为消灭HC亚临床感染，多采用加大免疫剂量的方法。欧洲药典规定用C株疫苗免疫时，肌肉注射剂量为100PD50（400RID）。五、 猪瘟疫苗生产工艺改进的几点考虑1、 使用化学成分明确的细胞培养基化学成分明确的细胞培养基一方面能提供足够的营养，供细胞生长，同时避免动物来源成分（如由水解乳蛋白）带来外源病毒（如BVDV）及其抗体的污染。2、 使用低血清细胞培养基

7、，减少血清使用量，提高细胞维持时间清大天一有适合细胞培养生长的低血清MEM（MD611）细胞培养基，可使血清使用量减少50左右，减少了外源因子污染的几率；并且由于该细胞培养基营养成分较传统细胞培养基丰富，可提高细胞活力水平，增加细胞维持时的营养供给。3、 使用改良的转瓶培养细胞使用多层转瓶培养细胞可使单位体积溶液内的细胞数量增加，一方面提高了细胞密度，病毒增殖数量较大；另一方面也对病毒液进行了浓缩，提高了病毒原液的病毒量。4、 尽量减少水解乳蛋白的批间差，防止疫苗生产过程的不稳定情况。5、 使用质量保证的牛血清血清是牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的主要来源，使用质量可靠、无外源病毒的血清可减少此类污染。6