越橘组织培养研究进展

1、越橘组织培养研究进展论文摘要：研究越橘离体繁殖影响因素，筛选越橘离体所需最正确启动、增殖和生根培养基及培养条件。为开展越橘产业化生产及建立越橘工厂化育苗，越橘商品基地的建立提供充足优良的苗木及提供技术支撑。论文关键词：越橘,组织培养,快速繁殖越橘，又称蓝莓，属于杜鹃花科乌饭树属(Vaccinum)，为多年生落叶或常绿果树，呈灌木状生长。果实为浆果，蓝色，近圆形;单果重0.52.5g，最大可达3.55.0g果肉细腻，种子极小，甜酸适中，具有宜人的香气，可鲜食，也可加土成果汁饮料、果酒等饮品。越橘果实深蓝色，富含花色苷，低糖、低脂肪，抗氧化能力名列所有果品、蔬菜之首，对防止人体细胞衰老，预防老年性

2、疾病，如心脏病、白内障、癌症、记忆力衰退等，具有特殊的成效，是国际粮农组织公布的五大健康食品之一，在美国、日本等兴旺国家都已引起重视，成为一种很有开展前途的小果类果树。越橘是一种新兴的保健水果，在医药、化装、食用色素和食品加工等方面有广泛用途。越橘果实深蓝色，抗氧化能力名列果蔬之首。果实所含的花青素是迄今已被利用的最正确天然色素，加工稳定性高，色泽呈深红、紫红或蓝紫，作为药物或高级化装品的原料均具有十分广阔的前景。近几年，其鲜果和加工品风行欧美等兴旺国家，虽然价格昂贵但仍供不应求。北美地区的产量已远不能满足本地和国际市场的需求，为此荷兰、加拿大、澳大利亚、日本、智利等国家先后引种栽培，现已初具

3、商品产量。1组织培养技术研究1.1无菌繁殖系的建立越橘的离体培养已成为快速繁育无病毒苗木的主要途径。随着品种的更新换代及生产上对优良品种的无病毒苗木的大量需求，越橘茎尖和叶片培养将更为迅速的开展，并发挥越来越大的作用。在茎尖和叶片培养中，无菌繁殖系建立是整个培养过程的根底，遇到的困难也较多，其中降低外植体接种的污染率、提高分化率是最为首要的间题。为减少各个过程中组织培养褐变的发生，参加活性炭和抗坏血酸都能到达明显的效果，而且抗坏血酸的效果要比活性炭更好，在其浓度为100mg/L时，褐化率仅为13%，而且褐化率与实践长短成正相关。目前诱导越橘芽再生的激素主要是ZIP、ZT、ZTR和TDZ，ZIP

4、使用中通常浓度较高，虽然ZT和ZTR的不定芽诱导率通常是ZIP的数倍，但ZT、ZIP价格昂贵。TDZ对越橘的一些品种不能实现再生，并且ZIP、ZT和ZTR也不能在所有越橘品种中实现再生。Samir(2005)以茎段为外植体，在对越橘的3个栽培种(Regal、Splendor、Emtedank)和2个无性系变种(NL1和NL2)腋芽增殖研究中发现，碳源的种类、浓度及它们之间的相互作用对枝条再生具有影响。在葡萄糖、山梨醇和蔗糖3种碳源中，虽然葡萄糖对促进再生枝条的生长与蔗糖具有同样的作用，而且在葡萄糖浓度为10g/L，时，对NL1种的培养效果好于蔗糖，但蔗糖为20g/L时培养效果最好，包括外植体的

5、培养反响和芽再生潜力；碳源的浓度对于腋芽的萌发几乎没有影响。再生培养基中蔗糖的浓度变化对立体叶片的再生频率和平均不定芽数有着明显的影响。再生培养基中蔗糖浓度为20g/L时最适宜越橘茎尖的不定芽的发生，再生频率和平均不定芽数最高。外植体的种类是影响组织培养的重要因素之一。不同组织和器官，因为其不同的生长发育阶段和特性，在组织培养中产生的效果是不同的。许多植物以茎段作为外植体诱导愈伤组织的成功率要远远高于用其他外植体诱导李淡等，2003。对于越橘而言，外植体采集最好选择水培后萌发的芽或在春季采集，此时不仅植株生长旺盛，并且能够有效降低污染率，幼龄植株的分化能力也较强。同时应尽可能选择在一年生或当年

6、生枝条上采集外植体。王连润等人以夏普蓝、戴安娜等六个蓝莓品种为外植体于立1O月中旬从田间健康生长的植株上选取带壮芽的休眠枝条，去除叶片后用洗洁精溶液洗净，流水冲洗20rain。在超净台上将枝条剪成3-4cm茎段，每个茎段带1-2个隐芽。结果显示，以带隐芽的健壮材料建立无菌苗，其污染率低，最高不超过8，成苗率高，90以上的芽能抽梢形成正常的绿苗。在越橘上已能从叶片、胚HrlskoD.1993等外植体上诱导出不定芽，根的外植体诱导尚未成功。大局部报道都是进行越橘诱导叶片直接再生不定芽。据报道，高丛越橘，兔眼越橘研究说明，可以通过叶片诱导分化不定芽。矮丛越橘的组织培养产生不定芽和愈伤组织那么通过子叶

7、或胚偶尔获得。利用非子叶叶片器官诱导不定芽再生也有一些报道。Chernik等1992对上胚轴直接诱导不定芽进行了研究，Sidorovich等对种子和胚诱导生成不定芽也做了研究都未成功。由于植体先诱导愈伤组织，再诱导不定芽也是越橘组织培养的一个途径。目前已能从多种外植体诱导出愈伤组织进而分化出不定芽。以幼叶作外植体进行培养时萌动能力较弱，即使延长培养时间也不萌动，并且开始褐变死亡，经两代培养后死亡率到达80%；老叶的污染率低，萌动率高，但死亡率也很高，并且愈伤组织及芽的诱导比拟困难，出现少量的愈伤组织，但在以后的培养中始终维持这种状态不变，成苗率的几率很低；茎尖在培养过程中表现最正确，污染率、死

8、亡率相对均较低，能迅速成芽，节处逐渐膨大，有愈伤块产生，萌动率很高，到达了79%同时污染率也比拟低。对外植体进行低温预处理可以减少褐变的发生，由于低温抑制多酚氧化酶的缘故，可使外植体处于旺盛的生长状态，减少了褐变的发生。研究表示低温处理的那局部枝条萌动的多，褐变的少，萌动率为60%，褐变率为36.7%，而未低温处理的那局部枝条萌动的少，褐变的多，萌动率为40%，褐变率为70%。黄文江等人以7个北高灌蓝莓和2个南高灌蓝莓为试材，从田间健康生长的植株上剪取带壮芽的休眠枝条,室内插瓶水培催芽,待芽突破鳞片露出绿芽时,把枝条剪单茎段。研究结果显示，采用室内水培催芽,以萌动的芽为原始材料建立无菌苗,其污

9、染率低,最高不超过5%,成苗率高,95%以上的芽能抽梢形成正常的绿苗。董朝莉采用两种外植体的灭菌方法175酒精浸泡10s，无菌水冲洗3次，01升汞浸泡10min，无菌水冲洗5次；275酒精浸泡10s，无菌水冲洗3次，12H2O2浸泡10min，无菌水冲洗3次，01升汞浸泡10min，无菌水冲洗5次。研究说明初代培养污染率较高，以茎或叶作外植体的污染率均在50以上。以叶片为外植体污染率高于用茎作外植体，增加H2O2灭菌程序对加强灭菌效果不明显，且对外植体严重杀伤。1983年Wolfe比拟了7种培养基，发现Lloyd和McGown的WPM(WoodyPlantMedium)培养基效果最好。一般培养

10、的类型均以RowlandLJ等的改进WPM根本培养基。改进的WPM根本培养基(Lloyd和Mc-Cown,1980),添加玉米素0.5-2.0mg/L。制备改进培养基时用Ca(NO)-4HO684mg/L、KNO190mg/L、CHFeNNaO73.4mg/L和盐酸硫胺素0.1mg/L,取代原WPM培养基中的KSO、CaCl、FeSO和NaEDTA。大量研究结果说明，植物激素的种类和配比是决定形态发生启动和分化方向的关键。WPM培养基是木本植物组织培养应用最多的培养基之一。目前越橘组织培养多项选择择WPM培养基和改进的WPM培养基。马艳丽(2005)以4种越橘的不同外植体为试材，配合4种培养基

11、进行越橘组织培养试验，结果说明:改进MS培养基对高丛越橘(Vacciniumcorymbosum)组培效果较好，再生频率达75.0%;改进WPM培养基对半高丛(Vacciniumcorymbosum/angusifolium)和矮丛越橘(Vacciniumangusifolium)分化增殖效果较好，再生频率达85.3%和79.2%;改进knops培养基比拟适合兔眼越橘(Vacciniumashei)的培养，再生频率85.0%。不同种类的植物生长调节剂在组织培养过程中具有不同的作用，而不同种类的激素之间的组合也会有不同的效果。在以叶片为外植体研究过程当中，Sharon(1988)采用WPM培养基

12、附加10-15um2ip诱导伯克利(Berkeley)和Bluehaven无菌苗叶片再生，4周后，叶片不定芽的再生率高达70-100%。Rowland等于1992年对建立越橘叶片再生体系进行了研究中得出，复合型细胞分裂素玉米素核甘(ZTR)要比自由型的细胞分裂素如ZIP或ZT在越桔叶片再生方面的效果好。1992年，Lisa报道用20uM的玉米素核普比15uMZip更能有效诱导出不定芽，诱导率可提高5倍，所用材料为高丛越橘无菌苗的叶片。Rowland(1994)等于1992年又对建立越橘叶片再生体系进行了研究，实验中添加20umol/LZT的处理与参加15umol/L2ip的处理不定芽分化率比值

13、是6:1。Filipenya以蔓越橘为材料，建立再生体系，研究试验说明l/2WPM添加1mg/L2iP+0.5mg/LTDZ或5mg/L2iP+0.2mg/LTDZ具有最高的不定芽再生率，而且该条件下诱导的不定芽丛在无激素的培养基上伸长生长频率最高。在以茎尖为外植体的研究过程当中，董朝莉采用改进WPM为根本培养基，研究越橘的组培育苗技术。结果说明：以兔眼越橘当年生绿枝茎段为外植体可有效获得无菌苗；越橘茎段的离体增殖率受到培养基中细胞分裂素的调控，ZT1-2mg/L和2ip10-20mg/L的效果较好。为了获得无菌，选择杀菌效果好、但对试材破坏力较小的杀菌方法及处理时间尤为重要。消毒时间以0.1

14、%升汞浸泡6min最为适宜，8min次之；消毒4min，材料外表消毒不彻底，污染严重；消毒10min/12min虽然消毒效果较好，但又容易把材料杀死致使外植体褐变，存活率降低。培养条件一般在根本培养基中添加蔗糖20mg/L,琼脂6g/L,用1N的NaOH调节pH值5.2,培养基在121、131Kpa的条件下灭菌20min.接种后培养在温度为252,光强度为2500Lx,光周期为16h黑暗8h光照的，条件下。刘树英等研究发现照顾强度为3000和4000Lux为芽增值的最适光强，芽增殖数量多切增殖系数分别达4和4.5；还指出PH为5.4时培养生长长度达7-9cm。通过实验研究说明，黑暗条件有利于越

15、橘的不定芽的诱导。1996年，Rida(1996)进行叶片培养时，先在黑暗条件下预培养两周，有效地提高不定芽的诱导率。邢瑞丹等以Sunrise和Geo两个越橘品种试管苗叶片为外植体材料结果说明：最适的暗培养时间为14d，近轴面放置效果最好。1.2继代增殖培养不用外植体的类型对越橘继代培养也有着明显的影响，研究说明叶片产生的芽在初期与茎段节处萌发的腋芽相比拟弱小，但是经过壮苗培养后长势可跟上腋芽，1个叶片可出芽2-8个。宁志怨在在越橘丛生芽的诱导上利用改进MS培养基，MS+2mgLZT+o2mgLNAA的增殖培养基上，经过两次继代培养后越橘的增殖系数可到达30-50倍左右。并且发现利用在初代培养

16、过程中参加维生素C从而有效的提高了越橘茎段的抗氧化性和防止了越橘茎段的褐化。刘树英对园蓝Gardenblue等七个兔眼越橘说明，茎段芽的萌发生长适合的激素配比为15mg/L2ip+0.02mg/LNAA，并且2ip的浓度为15mg/L时，及ZT的浓度为3mg/L时对芽的萌发有利。把当年生枝条剥去芽鳞，切去基部的受损组织，接种于诱导芽萌发的培养基中。2周后开始萌发；5周后芽长成4-5cm左右的新梢，侧芽同时也萌发出2-4个不定芽。和加卫和徐中志等人在云南越橘当年生休眠枝条上去外植体在添加ZT浓度为0.5的改进WPM获得成功。研究说明以：以北高丛越橘Sunrise和南高丛Geo两个越橘品种试管苗叶

17、片为外植体材料，以改进的WPM为根本培养基，不同基因型不定芽再生能力不同，Sunrise品种在WPM+4.0mgLZT+0.3mg/LIBA+1.0mgLTDZ+20gL蔗糖+6gL琼脂培养基中生长最好，离体叶片不定芽再生频率达100，再生不定芽数可达4.5个以上；Geo品种最适宜培养基为WPM+4.0mgLZT+0.3mgLIBA+20L蔗糖+6gL琼脂，叶片不定芽再生频率到达100。1.3愈伤组织诱导及分化在对矮丛越橘Blomidon品种的试管苗叶片为外植体的愈伤组织研究过程中，韩婷婷等发现1/2WPM为适宜的培养基;添加0.5mg-LCPPU+1.0mg-LZT+0.5mg-LTDZ和0

18、.5mg-LCPPU+0.5mg-LZT+1.0mg-LTDZ诱导愈伤率较高达100%；以1/2WPM+0.5mg-LCPPU+1.0mg-LZT+0.5mg-LTDZ,其诱导愈伤组织50d后转接平均分化芽数最多达10.26个。不定芽形成后，不切割转接于继代培养基上。经过4周培养，在不定芽基部长出许多小的不定芽，形成不定芽丛。把丛生芽分割成2-3个为一丛的芽丛，转接到培养基中进行继代培养，6周左右可继代增殖1次。Nickerson(1978)、Cohen1980等的研究证明2ip，即f6一(3一甲基一2一丁烯基氨基)嘌呤对试管越橘有增殖幼枝的作用。陈慧都研究结果显示选用玉米素最适浓度为0.5-

19、1mol/L接种单芽茎段外植体可迅速萌芽长出幼枝，试验品种为半高丛越橘的Northsky,Northblue以及矮丛越橘的Blomidon.Brunswick4个品种。刘庆忠等人对对6个北高丛越橘品种和2个南高丛越橘品种通过研究说明，在改进WPM附加玉米素0.5-2.0mg/L的增殖培养基上，增殖倍数达50倍以上。1.4试管苗生根培养以往的越橘微体繁殖研究,一般均在试管外生根或在弥雾条件下扦插试管幼枝生根。研究结果显示最正确生根培养基的激素组合1/2WPM+0.1mg/LBA+0.3mg/LNAA生根率可达42.9%。越橘属的很多植物都是没有侧根，根系较弱。据报道，越橘在试管内生根较慢，且生根

20、率低，在1/2WPM添加IBA的培养基中，培养20d生根率还不到10%，培养40d后生根率也仅30%一70%。而且生根试管苗长势弱，根较细。刘庆忠试验中也发现，试管苗在黑暗条件下预培养12周，可以提高生根率。越橘组培苗在试管内生根效果不佳,生根慢,生根率仅为30%-70%，因而主要采用试管外生根方法。将试管苗幼枝基部培养基洗净,用1000、2000、3000mg/LIBA速蘸(1S)处理,扦插于腐苔藓培养基上,培养盘上扣小拱棚置于温室内,冬季棚温控制在15-25,夏季不超过28,培养20d后即可生根,生长良好。刘庆忠等人在1/2改进WPM附加IBAO.lmg/L的生根培养基上，培养40d后生根

21、率到达30%-70%。对高丛越橘研究说明在生根培养基中培养4-5周后,即可将生根的小植株或未生根的新梢移栽于草炭土与河沙为11的基质中。移栽后小拱棚封闭保湿40d以上,小植株恢复健壮生长后慢慢放风。每隔2周浇灌1次0.5%的FeSO溶液,成活率可达50%以上。取继代培养的芽苗转接于生根培养基中，5周后基部可长出2-4条1-1.5cm长的不定根，生根率78%。国内多数研究说明1/2WPM培养基对越橘生根效果较好。和加卫认为1/2WPM+NAA0.05。李晓燕、张志东采用北陆(Northland)、圣云(St.Cloud)、蓝丰(Bluecrop)、美登(Blomidon)、芝妮(Chignect

22、o)、埃利奥特(Elliott)等品种带芽茎段作为外植体接种改进的WPM+ZT0.3-0.7mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L培养基进行培养认为越橘组培苗良好的遗传稳定性可能与采用适宜的繁殖方式(带芽茎段)、激素种类与浓度(ZT0.3-0.7mg/L)等有关。孙阳等对三种越橘品种Sierra、Bluecrop和Toro叶片离体再生研究，以改进WPM培养基，结果说明。ZT浓度在0.15mg/L时对越橘叶片离体再生效果最正确,IBA对越橘叶片离体再生能力影响较小。不同品种之间的叶片生根速率差异十分显著,在相同生长素浓度下,3个品种的生根率由低到高依次是Bluecrop。以带芽茎段为外植体徐宏等

23、人研究说明，不同的越橘具有不同的最正确繁育方法,高丛和半高丛越橘适宜组培繁育,越橘在丛生生根培养基1/2WPM+IBA0.1mg/L培养,生根率达30%-70%,试管苗经温室锻炼后成活率达60%。1.5试管苗的驯化移栽当再生植株分化出3-5条，长在2-3cm左右的健康不定根时，对这些健壮的再生植株进行炼苗及移栽。越橘再生苗移栽时，对土壤的要求不高，需要透气性好，土壤PH值最好保持在5左右，采用含腐殖质丰富的土壤作为基质，混合局部草炭土和少量有机肥，经驯化的再生苗在培养2-3周后就可以适应外界的条件，成活率可以到达90%以上，生长状态良好。王连润等人以夏普蓝、戴安娜等六个越橘品种为外植体，在生根

24、培养基上生长60d的健壮生根试管苗置于移栽环境3-5d，移栽前1-2d将瓶口翻开，在自然光照射下炼苗。移栽时将试管苗从瓶中取出，洗净根部附着的培养基，然后移入经800-1500倍敌克松;消毒处理的草炭与珍珠岩1：1的基质，移栽后用塑料小拱棚保温保湿，两周后植株可陆续长出新根，逐渐恢复生长。待苗稳根恢复生长后每隔2周浇灌一次0.1%FeSO溶液，移栽成活率可达85%以上。刘庆忠等人对高丛越橘研究说明将经温室锻炼的试管苗,移于室外炼苗1周,然后移栽到沙壤土中,移栽前在畦内撒少量草炭土,移栽后于生长季浇灌FeSO溶液2-3次。保持土壤湿润,加盖遮荫网。移栽后当年生长量可达50cm,翌春可有60%的植

25、株开花结果。2.组织培养在越橘上的应用及展望2.1脱毒采用组织培养技术，对保存我国的越橘种质资源和开发利用可能有一定的应用价值。越橘的组培苗在阶段发育上比常规法育成的苗更健壮。可以得到无病毒和不带菌的苗木;繁殖速度大大快于常规方法;不受季节限制;组培苗在阶段发育上比常规法育成的苗更健壮。研究培养基、激素、转接时间及转接方式对愈伤组织形成和植株再生的影响,拟初步建立越橘品种叶片及茎尖再生体系,以期为越橘品种的快速繁殖、种质资源保护、遗传转化与种质创新等提供理论依据和技术支持。2.2育种越橘的育种已经进入一个新时代,小落叶果树,模式植物,越橘是一种新兴的小浆果类果树,它的营养和保健价值极高,果实中

26、含有较多的花色素苷、黄酮等生物活性成分，随着广阔农民生活水平的提高,保健意识的增强,越橘鲜果及其加工产品在国内外市场的需求量越来越大,供不应求的现象持续加剧。因此,不少学者对优良越橘品种微体快繁技求展开研究,以便建立完善的组织培养体系,为大规模工厂化生产提供理论依据。越橘在一般自然状态下以二倍体和四倍体2种形式存在,但由于越橘的杂种杂合性,使得采用传统育种手段进行越橘育种既费时又费力。使用组织培养的方法为越橘育种提供了有力的途径。而且加速了育种进程，对进一步促进越橘资源的开发利用具有重要意义。随着组织培养及遗传转化技术的日趋成熟,为越橘的快速繁殖培育新品种奠定了良好根底。3.结语关于越橘的组织

27、培养繁殖,美国已有大量的报道,分别在高丛越橘、矮丛越橘、半高丛越橘和兔眼越橘上获得了离体繁殖,而国内尚无报道.国外越橘离体繁殖研究中所用的细胞分裂素多为2ip玉米素核苷和TDZ,这为我国蓝莓的工厂化育苗和商品基地的建设奠定了根底。越橘果实深蓝色,富含甙,低糖、低脂肪,抗氧化能力名列所有果、蔬之首。对防止人体细胞衰老、预防老年性疾病,如心脏病、白内障、癌症、记忆力衰退具有特殊的功率,因而被国际粮农组织列为5大健康食品之一。果实鲜食、加工皆宜.皮薄、粒小、风味甜美,可食率几乎达100%,深得消费者喜爱.所含的花青甙类色素是迄今已被利用的最正确天然色素,加工稳定性高,色泽呈深红、紫红或蓝紫,作为药物

28、或高级化装品的原料均具有十分广阔的前景.近几年,其鲜果和加工品风行欧美等兴旺国家市场,虽然价格昂贵但仍供不应求,其传统的北美产区的产量已远不能满足本地和世界市场的需求,为此世界上其他国家已先后引种.我国有着可以生产越橘的广阔天地,南方红黄壤土地面积达2179600km占全国土地面积的22%,其中2040000km土壤属酸性,而且很大一局部pH，由于土壤酸度大和肥力缺乏,农业生产水平较低,人民生活水平低下。越橘特别适合酸性和强酸性土壤,正是红黄壤地区脱贫致富的理想作物。参考文献1 Sharon, CzBilling, Chee K.Chin, and GojkoJelenkovic.Regene

29、ration of blue berry plantlets from leaf segments.Hortscience,1988,23(4): 763-7663 FiliPenya V.L.,DolgovS.V.Effect of combinations of Phytohormones on morfogenesis in tissue cultured leaves ofAmerican cranberry(vaciinium macorpon).Acta Biochim Pol.,2007,54(4):733一7404 Rida A.,Shibli M. A and Smith L

30、,Direct shoot regeneration from Vaccinium Pahalae(Ohelo)and V.myrtills(Bilberry)leaf explant.Hortscience, 1996, 31(7):1225一12286 Wo1fe, D. E., Eck, P. and Chin, C. K,: Evaluation of seven media for micropropagation of highbush blueberry. Hori. Science, 1983, 18: 703-7057 Rowland L J,Ogden E L.Use of

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