基因工程论文

1、.：.；国内外利用不同受体细胞开发生物反响器的研讨进展情况摘要：利用受体作为生物反响器消费外源蛋白,包括抗体、疫苗、药用蛋白等较之其他消费系统具有很多优越性植物生物反响器是生物反响器研讨领域中的一大类, 是指经过基因工程途径, 以常见的农作物作为 化学工厂， 经过大规模种植消费具有高经济附加值的医用蛋白、工农业用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂类及其他一些次生代谢产物等生物制剂的方法 。关键词：受体细胞;转基因; 生物反响器；基因药物一 受体细胞作为生物反响器一、酿酒酵母是第一个用于基因药物表达的酵母菌，遗传背景已相当清楚：有17条染色体，1996年完成其全基因组测序，基因组为12068

2、 kb，阅读开放开架5887个，编码约6000个基因，比单细胞的原核生物和古细菌大一个数量级。受体细胞举例：酿酒酵母GRF18运用1981年酿酒酵母表达了 第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达。 FDA同意的第一个基因工程疫苗就是酿酒酵母表达的乙肝疫苗Merck公司上市产品还有人胰岛素丹麦Novo Nordisk公司和人粒细胞集落刺激因子Immunex公司等 存在问题1、外源基因表达程度不高。缘由：1密码子运用的偏向性tRNA与外源基因密码子不匹配2乙醇发酵途径活泼导致生物大分子合成普遍遭到抑制3质粒的不稳定性2、重组异源蛋白超糖基化修饰二、巴斯德毕赤酵母Pich

3、ia pastoris是近年来发 展最为迅速，运用最为广泛的酵母细胞。是一种甲基营养菌，能在相对较为廉价的甲醇培育基中生长。优点除具有普通酵母所具有的特点 外，还有以下几个优点：1、具有目前最强，调控机理最严厉的启动子之一 乙醇氧化酶AOX1基因启动子,外源蛋白表达量高普通 500-4000mg/L，最高为破伤风毒素C到达12g/l 。 2、表达质粒能在基因组的特定位点稳定整合。 3、蛋白产物糖基化修饰作用大多数情况下接近哺乳动物细胞且可直接以天然可溶方式分泌到胞外。缺陷发酵周期长，要添加甲醇分子生物学根底不清楚，遗传改造难度大。运用 消费重组真核药物蛋白： 近年来，Invitrogon公司开

4、发了毕赤酵母表达系统的系列产品，短短几年曾经有300多种外源蛋自在该系统得到有效表达，被以为是目前最有效的酵母表达系统。 药物蛋白已有20多种，见 李元P52表。如人IL2、人血洁白蛋白、TNF、HBsAg、EGF、破伤风毒素C片断、人巨细胞病毒抗原、抗凝血因子水蛭素衍生物等，有些即将进入市 场。常用毕氏酵母菌 KM71和GS115:都具有HIS4营养缺陷标志。 GS115茵株：具有AOX1基因，是Mut，即甲醇利用 正常型； KM71菌株：AOX1位点被ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型 共同特点:为组氨醇脱氢酶缺陷株，与带有his标志基因的表达质粒配合运用三、乳酸克鲁维酵母

5、具有可稳定存在的附加体型质粒pKD1载体及高拷贝整合型质粒pMIRK1外源基因表达程度比酿酒酵母高，如由重组乳酸克鲁维酵母合成的人IL1是重组酿酒酵母的80100倍。四、多型汉逊酵母表达系统蛋白糖基化修饰作用接近哺乳动物细胞。也是一种甲基营养菌。举例：利用重组酵母消费乙肝疫苗第一代乙肝疫苗：病毒携带者体内提取存在问题：1、来源有限2、提取过程复杂3、致病潜在危险4、本钱高第二代乙肝疫苗重组乙肝疫苗第一阶段：大肠杆菌重组乙肝疫苗。20世纪70年代末尝试用大肠杆菌表达乙肝外表抗原HBsAg，但表达程度极低第二阶段：酿酒酵母重组乙肝疫苗。起始于20世纪80年代初，将HBsHg或s多肽的编码序列置于A

6、DH1酿酒酵母的乙醇脱氢酶1基因启动子或PGK磷酸甘油酯激酶基因启动子后面，表达出具有免疫活性的非糖基化HBsHg 。目前已作为乙肝疫苗商品化，商品名为RecombivaxB或EngerixB。第三阶段：巴斯德毕赤酵母重组乙肝疫苗HBsAg基因稳定整合在巴斯德毕赤酵母染色体上表达产物量比在酿酒酵母中高1倍，并且表达蛋白效价高出酿酒酵母数十倍。常用哺乳动物表达细胞能在培育基中无限生长的哺乳动物细胞系。普通为与正常细胞生理特性根本接近、无平面接触抑制特性的肿瘤细胞系或异倍体延续细胞系 有限细胞系和无限细胞系有限细胞系finite cell line：正常细胞经过多次传代后，普通可延续培育3050代

7、，就会逐渐失去增殖才干，也就是说它们只能生长有限的时间，经过假设干传代培育后将老化死 亡，把这类细胞称为有限细胞系。无限细胞系infinite cell line或延续细胞系continuous cell line：当细胞经过自然或人为的要素转化为异倍体后，能变为无限细胞系，没有分裂次数的限制。药物消费运用的主要细胞系非洲绿猴肾细胞COS、中国仓鼠卵巢细胞CHO 、小仓鼠肾细胞BHK、人胚胎肾细胞HEK239、 C127 用于基因瞬时表达： COS、 BHK、 HEK239用于基因稳定表达：CHO一、CHO细胞 Chinese hamster ovary cells细胞贴壁培育和悬浮培育 二优

8、点1、外源基因整合到宿主细胞后能稳定坚持；2、可分泌表达外源蛋白，而内源蛋白分泌很少。3、蛋 白质翻译后的修饰准确，表达产物的构造、性质和生物活性接近天然。4、培育条件要求低。对剪切力和浸透压有较高的忍受才干；能在无血清的条件生长。三运用有多个衍生突变株运用于药物的消费，培育时需求添加脯氨酸。采用二氢叶酸复原酶 DHFR的缺陷株*CHO/dhFr表达的药物有人组织性纤溶酶原激活剂 tPA、 IFN、IFN 、EPO、HBsAg疫苗、G-CSF、凝血因子等已投放市场。可在在氨甲酰喋呤 methotrexate,MTX存在下，添加外源基因的拷贝数，提高蛋白的表达程度，使外源基因高效表达。二、BHK

9、细胞一普通特性： 分别自幼仓鼠的肾脏baby hamster kidney, BHK 成纤维样细胞，非整倍体，2n=44。二运用：用于增殖病毒制备疫苗和重组蛋白。 两种重组凝血因子，Bayer的Kogenate FS、Aventis Behring的Helixate分别于1989和1994被FDA获准上市，1999年FDA同意Novo Nordisk的重组凝血因子VIIaNovoSeven上市，用于治疗血友病。三、C127细胞一普通特性： 分别自小鼠乳腺肿瘤 上皮样细胞，贴壁型生长。 被牛乳头瘤病毒bovine polyoma virus，BPVDNA载体转染后，细胞形状发生明显变化。 二常用

10、细胞系： C127：LT细胞系：生长密度高，表达组成型大T抗原。 C127I细胞：适宜于牛 乳头瘤病毒DNA载体的转化。三运用：已表达多种外源基因，Serono公司消费rhGHSaizen, Zorbtive于1996年被FDA已被同意进入市场。四、杂交瘤细胞一普通特性： 从小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的交融细胞中分别获得杂交瘤细胞系； 悬浮生长型 容易 转染和培育，能在无血清培育基中高密度悬浮生长；二常用细胞系：SP2/O、J558L和NS0等。三运用：制备抗体、表达其他外源蛋白如tPA等。五、Vero细胞一普通特性： 分别自成年非洲绿猴肾 成纤维细胞，贴壁依赖性，为延续细胞系。 多倍体核型，66

11、%细胞的2n=60 二常用细胞：Vero E6三运用： 1、增殖多种病毒消费疫苗，如脊髓灰质炎、狂犬病毒、乙脑病毒等。 2、表达蛋白质药物 3、病毒的检测六、COS细胞常用昆虫表达细胞家蚕Sf21和Sf-9来源：秋黏虫Spodoptera frugiperda，fall armyworm)卵巢细胞特点： 1、容易繁衍，倍增时间1824小时 2、可高效表达外源基因。 TN-5B1-4来源：粉纹夜蛾Trichoplusia ni，TN卵细胞；特点： 1、培育要求条件低，可用无血清培育基培育 2、快速倍增，能顺应悬浮培育。 3、分泌表达重组蛋白的才干比SF9细胞系高20多倍。二 生物反响器存在的主要

12、问题主要论述植物作为反响器的主要问题2. 1转基因沉默是指转基因在受体植物中往往不能稳定表达,有时甚至完全不表达,或者说利用遗传转化方法导入并稳定整合进受体细胞中的完好的外源基因在当代转化体或在其后代中表达遭到抑制的景象。其可以经过以下途径处理: 探明影响植物基因表达的基因调控元件,加以修饰和开启控制; 了解转录过程,以便在转录程度进展基因操作,提高转录效率; 研讨翻译过程,提高翻译效率; 构建一些新的植物高效表达系统,即各种载体及高效元件。2.2表达程度低大多数转基因植物经过自交后可以选择出目的基因纯合的后代,可以稳定遗传,使表型得以延续。但是大部分外源基因的表达程度在植物体内不高,目前没有

13、得到很好的处理。可以尝试用如下方法加以处理:采用适当的强启动子、加强子序列和前导序列,运用偏爱密码子,将转基因产物定向到适宜的细胞分隔(如细胞质、质外体、内质网腔、叶绿体液泡等) ,组织器官特异性表达(如种子、块茎、果实、橡胶树乳管等) ,去除mRNA不稳定序列,同时表达有助于产物正确折叠的酶或蛋白质(如分子伴侣) 。此外,还可用植物病毒作为载体提高表达量。虽然这一问题可以处理,但要构成一套完好的外源基因在植物体内的高效表达体系还有待深化研讨。2.3重组蛋白质中糖链构造的改动植物表达蛋白质的氨基酸序列和它的原始序列通常是一样的,并且在植物中能构成类似于人类等哺乳类动物的复杂型糖链构造,但是二者

14、在高尔基体中的糖基化过程存在较大差别。植物中糖蛋白短少唾液酸和半乳糖残基,特异存在2(1, 3) 2岩藻糖和2(1, 2) 2木糖。而唾液酸和半乳糖残基缺失会影响糖蛋白在人体内的稳定性及半衰期,使其活性降低;2(1, 3) 2岩藻糖和2( 1, 2) 2木糖的存在那么易引起人体内的免疫原性。为了防止植物高尔基体中特异的糖基化过程,人们发如今表达蛋白质的后面添加KDEL序列,可将蛋白质定位在内质网中,从而构成对人无免疫应对的高甘露糖型糖蛋白质,同时还可以提高蛋白质的表达量。2. 4下游消费本钱高虽然植物消费体系具有许多优点,但假设产物需提纯,其费用还是比较昂贵的,因此有待降低下游消费本钱,尽能够

15、地防止或部分防止表达产物的纯化,如用转基因植物消费直接口服疫苗。有时经过被修饰植物的直接消化运输生物药物产物能够不需求纯化,这种生物药物及可食用疫苗能以种子、块茎或果实的方式储存和分配,可以直接利用,这样就大大简化了下游的加工本钱。另外,也可将植物种子油脂体作为蛋白或肽类的载体,外源基因以交融蛋白的方式表达,油脂蛋白具有亲脂性使其成为高效的多肽纯化系统。2.5转基因药品的平安性问题目前,虽然经过植物生物反响器消费外源蛋白相对于动物和微生物来讲平安性更高一些,但是转基因产品的平安性仍存在争议,如在口服药物和口服疫苗方面,植物能否含有对直接口服蛋白有影响的因子。公众对转基因产品的接受和认可程度还不

16、够,从而使转基因产品的市场化进程遭到影响。因此,一方面要加大宣传普及力度,另一方面还要对转基因产品的潜在危险性进展充分评价,开发清洁载体,防止目的产物遭到污染,同时还要制定相应的平安和管理法规。展望虽然转植物生物反响器仍存在一些问题尚待处理,但利用植物表达系统已胜利地表达了多种具有生理活性的外源多肽,而且有些曾经进展了人体和动物的实验,其前景是可观的,随着人类基因组方案研讨的不断深化,会发现有更多医疗价值的蛋白质,因此利用转基因植物将会成为最具潜力的消费系统来消费这些药物,为人类安康做出宏大的奉献。三 求职应有的知识贮藏1.掌握数学、物理、化学等方面的根本实际和根本知识； 2.掌握根底生物学、

17、生物化学、分子生物学、微生物学、基因工程、发酵工程及细胞工程等方面的根本实际、根本知识和根本实验技艺，以及生物技术及其产品开发的根本原理和根本方法； 3.了解相近专业的普通原理和知识； 4.熟习国家生物技术产业政策、知识产权及生物工程平安条例等有关政策和法规； 5.了解生物技术的实际前沿、运用前景和最新开展动态，以及生物技术产业开展情况； 6.掌握资料查询、文献检索及运用现代信息技术获取相关信息的根本方法；具有一定的实验设计，发明实验条件，归纳、整理、分析实验结果，撰写论文，参与学术交流的才干。参考文献：1 庞俊峰; 黄东光; 吴燕民; HYPERLINK t _blank 植物生物反响器研讨

18、进展 HYPERLINK t _blank 生物技术通报, HYPERLINK t _blank Biotechnology Bulletin, HYPERLINK mailto:SWJT 编辑部邮箱 HYPERLINK t _blank 2021年 01期2 严萍,赵树进. 转基因技术在植物抗体上的运用J. HYPERLINK t _blank 生命的化学, HYPERLINK t _blank 2006,(01) .3 刘德虎. HYPERLINK t _top 利用转基因植物消费药用蛋白J. HYPERLINK t _blank 生物技术通报, HYPERLINK t _blank 19

19、99,(04) .4 杜小春; 何正权; 陈磊; 杨晔; 姚伟; HYPERLINK t _blank 植物生物反响器表达药用蛋白研讨新进展 HYPERLINK t _blank 中国生物工程杂志, HYPERLINK t _blank China Biotechnology, HYPERLINK mailto:SWGJ 编辑部邮箱 HYPERLINK t _blank 2021年 09期5 杨晶; 李天航; 熊丽东; 庞实峰; 李校堃; HYPERLINK t _blank 植物生物反响器的研讨进展 HYPERLINK t _blank 生物工程学报, HYPERLINK t _blank

20、Chinese Journal of Biotechnology, HYPERLINK mailto:SHWU 编辑部邮箱 HYPERLINK t _blank 2021年 05期6.Stephanopoulos G;Konstantinov K;Sauer U Fermentation data analysis and control , inBiotechnology( Rehm, H. J. Ed) 19937.Konstantinov K B;Artis R;Yoshida T On the selection of variables representing the physio

21、logicalstate of the cell cultures 19928.Stephanopoulos G Metabolic engineering外文期刊 19989.Fell D A Increasing the flux in metabolic pathways: a metabolic control analysis perspective外文期刊 199810.郁静恰;杨胜利 代谢工程 1996(02)11.Bailey J E Toward a science of metabolic engineering外文期刊 199112.张嗣良.储炬.庄英萍抗生素发酵过程优化技术研讨期刊论文-中国抗生素杂志 2002(9)13.蔡显鹏.储炬.庄英萍.张嗣良鸟苷发酵代谢过程分析期刊论文-食品与发酵工业 2002(9)14.扶教龙.储炬.刘玉伟.樊涛.庄英萍.彭皓宇.张嗣良金霉素发酵过程的代谢特性及调控战略期刊论文-中国抗生素杂志 2002(3)15.张嗣良发酵工程技术开展现状与趋势期刊论文-生物产业技术 2021(1)16. HYPERLINK f.g.wanfangdata/download