油浸镜的使用和细菌形态结构的观察

1、.PAGE ：.；-PAGE 93- 实验一 油浸镜的运用和细菌形状构造的察看Use of oil immersion objective and observation of morphoiogy structures lf bacteria一、油浸镜的运用方法图1 油浸镜原理表示图察看细菌时，须用放大倍数最大的物镜，即油浸镜Oil immersion objective，简称油镜。其原理如图一所示，当光线从标本经过空气进入镜头时，由于介质密度不同而发生光的折射散光景象，光线不能完全进入物镜中，致使物象显现不清。假设在油镜与载物玻片中间参与和玻璃折射率n=1.52相仿的香柏油n=1.515，

2、那么不使经过的光线有所损失，视野亮度加强，获得明晰物象。(一)油浸镜的运用方法1、双手托显微镜，轻拿轻放。2、放好后，用绸布擦试显微镜，同时检查显微镜有无问题，有问题立刻向教师报告。3、用低倍镜调整光线，看染色标本时，要求视野到达最亮的程度。将集光器升到最高位置，与载物台相平。将虹彩完全开放。天然光线用平面反射镜，人工光源用凹反射镜。使视野到达最亮的程度。4、在标本上滴一滴香柏油，不要多加。用眼睛从侧面察看，小心转动粗调理器，使油浸镜头缓慢下降，浸入油中，到几乎或悄然与玻片接触为止。不能过急过重，以免碰坏镜片。5、一面从目镜察看，一面用粗调理器渐渐上升油浸镜头，当见到模糊的物象时，立刻停顿。再

3、用细调理器调到物像明晰为止。然后，一边挪动片子，一边察看，寻觅理想的视野，仔细察看。6、看完后，先将油浸镜头上提，然后取下标本片，再用擦镜纸拭去镜头上的香柏油。必要时，用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭镜头，然后再用另一小块擦镜纸拭去二甲苯。7、最后，降下集光器，竖起反射镜，下降镜筒使物镜成八字形抵于载物台绸布上，双手托持显微镜，放入显微镜箱中。(二)本卷须知1、不得在直射阳光下操作显微镜，以免强光损坏镜片。2、显微镜的细调理器是精细而脆弱的机件，只能做有限的旋转，因此，不得向一个方向延续旋转数周。当旋转时感到有阻力，那么阐明已达极限，不能再继续向上方旋转，必需立刻退回，轻拿轻放，防止细调理器因震动而损

4、坏。3、显微镜必需保管于枯燥、无尘的方，以防镜片发霉损坏。二、细菌的根本形状、特殊构造的察看细菌的根本形状球菌、杆菌、螺形菌和细菌的特殊构造荚膜、鞭毛与芽胞等都可以在染色之后，用油浸镜察看(一)细菌的根本形状察看留意察看细菌的形状、大小、陈列和染色性。1、球菌和杆菌葡萄球菌和大肠杆菌革兰氏染色标本，葡萄球菌染成紫色，大肠杆菌染成红色。2、弧菌霍乱弧菌革兰氏染色标本，霍乱弧菌染成红色。(二)细菌的特殊构造察看1、荚膜肺炎球菌Hiss氏荚膜染色法，菌体染成紫色，荚膜染成淡紫色或无色。2、鞭毛变形杆菌户田氏鞭毛染色法，菌体和鞭毛均染成红色。3、芽胞破伤风杆菌Moeller氏芽胞染色法，菌体染成兰色，

5、芽胞染成红色。三、细菌大小的测定细菌及其它一些微生物的大小，通常用测微计来丈量，测微计分接目测微计与镜台测微计二种，接目镜刻度是相对的，在同一接目镜下，它是随着不同放大率的接物镜而改动相对比例，而镜台测微计上所刻的长度是绝对的用来校正接目测微计每格所代表的大小。资料：光学显微镜、接目测微计、镜台测微计。方法：1、将接目测微计装入接目镜内的横隔上，刻度向下，置镜台测微计于镜台上。2、在接目镜下寻镜台测微计的刻度这光阴圈宜小，因光线暗才干使刻度更为清楚。需求用那一放大率的接物镜察看标本，那么在校正接目测微计时就用那一个接物镜头。3、挪动镜台测微计和转动接目测微计使二者刻度平行，并使二者的起始线相重

6、迭，数出二条重迭线之间在两个测微计上的格数即可求出接目测微计每格的长度。接目测微计与镜台测微计二个重迭点间的间隔 越长，那么所得的数字越准确。4、接目测微计每格长度的计算：镜台测微度总长度为1毫米，其上刻有10大格，每格划有10小格，所以每小格=1/100=10m由于1mm=1000m。例：今测得高倍显微镜油镜的接目测微计50格相当于镜台测微计7格，那么接目测微计每格长度为：5、校正后移去镜台测微计，将细菌玻片标本置于镜台上，找到目的物后，挪动接目测微计或挪动标本，测定细菌长与宽各占儿格，求得其大小。细菌的大小=测得之格数接目测微计每格长度。6、实验终了后，取出接目测微计，其中如有油腻或手印，

7、那么用擦镜纸拭净。实验二 常用培育基的制备和常用热力灭菌器及运用方法Preparation of common culture medium and sterization methods by heat一、常用培育基的制备培育基是用人方法将多种营养物质按微生物生长需求配成的一种营养基质。常用的培育基有根底培育基、营养培育基、选择培育基、鉴别培育基、厌氧培育基等。其制备步骤大致是：按一定配方称取各种物质、溶解、修正pH，分装在一定的容器内，灭菌。运用前保证无菌形状。常用的培育基有以下几种，简介其制备方法和用途。(一)肉汤培育基资料：肉膏 0.5g蛋白胨 1.0gNacl 0.5g蒸馏水 100

8、ml方法：1、将上述资料混合，加热溶解，放凉。2、用精细pH试纸试酸碱度，用10碳酸钠Na2CO3-或1N氢氧化钠NaOH矫正pH为7.2左右。过碱时可用10醋酸或1N盐酸矫正。必要时可用比色箱或酸度计更准确地测定酸碱度。3、分装于试管中或放三角烧瓶中，用15磅高压蒸气灭菌20-30分钟。待用。用途：主要用于增菌和察看细菌在液体培育基中的生长形状沉淀生长、混浊生长和外表生长。(二)营养琼脂培育基资料：合成营养琼脂 4.8g视制剂阐明 蒸馏水 100ml方法：混合，加热溶解，勿需调pH。分装于试管和三角烧瓶中，一并高压灭菌。灭菌后，将试管倾斜放置，冷却后那么成斜面培育基；三角烧瓶中的培育基趁热倒

9、入灭菌平皿中，冷却后即成琼脂平板。用途：琼脂平板用于分别细菌等；琼脂斜面用于细菌纯培育和菌种保管等。(三)血液琼脂培育基资料：营养琼脂培育基 100ml 脱纤维的新颖羊血或兔血 5-10ml方法：将营养琼脂加热溶化或高压灭菌后，待冷即到50左右时，无菌操作将羊血或兔血参与后混匀，分别注于无菌平皿或试管中，制成血平板或血斜面。用途：供培育要求较高的细菌。(四)半固体培育基资料：合成半固体培育基 1.0g视阐明 蒸馏水 100ml方法：混合，加热煮沸溶解，分装于小试管中，高压灭菌后，直立，使之凝固成高层。用途：供测定细菌的动力和保管菌种。(五)蛋白胨水培育基资料：蛋白胨 1.0g Nacl 0.5

10、g 蒸馏水 100ml方法：1、按量称取后混合加热溶解。2、矫正pH为7.2-7.6。3、分装后高压灭菌。用途：蛋白胨水中不含糖类，常用于制备糖发酵培育或用检查细菌的靛基质反响等。二、常用热力灭菌器及其运用方法示教高温能使微生物蛋白质凝固变性，故高温能杀灭一切的病原微生物。在医学实际中常用下述热力灭菌。(一)干烤箱干热灭菌器干烤箱是用两层金属板制成的箱子，中间充以石绵，箱底有热源电炉，并附有温度计和自动调理器。灭菌时，翻开通气口，加热到80时，封锁通气口，加热到160-170时，坚持两小时，即可灭菌。最高温度不得超越180，超越180那么棉塞和包装纸会被烤焦。灭菌后，待温度下降到40以下，再开

11、箱取物，防止玻璃器材因骤冷而破裂。耐高热和干烤的玻璃器材、磁器等常用此法灭菌。如培育细菌用的试管平皿、吸管等，经清洗和晾干之后，进展干热灭菌。为了使灭菌后的器材坚持无菌形状，烧瓶和试管要塞上棉塞，平皿和吸管要放入特制的筒内或用纸包好再行灭菌。(二)流通蒸汽消毒器实验室常用的流通蒸汽消毒器，其原理和普通的蒸锅一样。消毒时，用流通蒸汽100蒸30分钟，可消毒用过的细菌培育物和病人的衣物等。10030分钟，不能灭尽芽胞，达不到灭菌的要求。一些不耐高热的含糖或牛奶培育基，可用流通蒸汽消毒器进展间歇灭菌，即每天10030分钟，延续进展三天；不加热时，把培育基放在室温中，使其中的芽胞发育成繁衍体，于次日加

12、热时将其杀死。(三)高压蒸汽灭菌器高压蒸汽灭菌器是一个能密闭的耐高压的金属圆简，附有加水、贮水、排水、加热、排汽活门、平安活门和压力计等安装。小型的手提式高压蒸汽灭菌器，构造简单，运用方便。高压蒸汽灭菌器的运用方法如下：1、先向筒内注水，然后把要灭菌的物品装入内筒，再把盖拧紧，翻开排气活门，开场加热。2、水沸腾后，排气活门开场排出气体，待筒内冷空气全部排出后，封锁排气活门。此时筒内压力逐渐上升。3、待筒内压力到达所需磅或公斤数时，调理热源，维持一定时间，普通是15磅温度为121.320-30分钟，即可到达灭菌的目的。4、到达灭菌所需时间后，封锁热源，自然放凉，待压力表指针下降到“0时，方可开盖

13、取物。运用高压灭火器灭菌，是最有效而又迅速的方法。凡不怕高热的普通培育基、药品、手术器械、外科敷料等，均可用此法灭菌。为保证灭菌效果和平安。器内要参与足量的水，装入的物品不要过挤，冷空气必需排尽，留意压力表的任务情况，防止因压力表失灵而呵斥事故。实验三 细菌的培育法和细菌的分布Bacterial culture and Bacterial distribution一、细菌的培育法根据培育基的物理性状液体、固体、半固体的不同，培育方法也不同。常用的培育方法有：平板培育法、斜面培育法、高层培育法和液体培育法。资料：琼脂平板、琼脂斜面、半固体高层和肉汤培育基，大肠杆菌、枯草杆菌的培育物等。方法：1、

14、平板培育法分别培育法：临床上常用的检验标本，如粪、痰、脓汁等中常混有多种菌。欲从病人标本中检出某种病原菌时，必需先将各种菌分开，获得纯菌，然后再做进一步鉴定，这样才到达目的。琼脂平板面积大，经过一定的方法进展培育，那么可到达分别各种细菌目的。平板培育法种类很多，现将三段划线法引见如下：将接种环火焰灭菌后，取检查资料，反复涂于平板上端。将接种环火焰灭菌后，把涂于平板上端的资料，划线于“1区。将接种环火焰灭菌后，把“1区部分资料划线于“2区。将接种环火焰灭菌后，把“2区部分资料划线于“3区。划线完了后，盖好平板，灭菌接种环。于盛琼脂的底面玻璃上注明日期和姓名，放37培育18-24小时。2、斜面培育

15、法：斜面培育基不易污染，常用于培育纯种细菌纯培育。先将接种环灭菌，然后挑取平板上弧立菌落上的细菌。拔去斜面培育基的棉塞，试管口经火焰灭菌，将沾有细菌的接种环伸入管内，自下而上划不断线，然后将接种环再自下而上，延续平行划线。接种后，管口在火焰上灭菌，塞好棉塞。灭菌接种。在试管上写好菌名，日期。37培育18-24小时。3、液体培育法：用于增菌，并可察看细菌的生长形状和检查生化反响。用灭菌接种环取少许纯菌。按无菌操作要求，将沾有细菌的接种环伸入液体培育管中，在稍高于液面的管壁上，悄然研磨，使细菌落入液体培育基中。接种后，管口在火焰上灭菌，塞好棉塞。灭菌接种环，在试管上做好标志。37培育18-24小时

16、。4、半固体培育法穿刺培育法：常用以检查细菌运动或检查细菌发酵才干。用灭菌接种环白金针取少许纯菌。按无菌操作要求，将沾有细菌的接种针，从半固体培育基的正中刺向管底，但不究竟，留有0.5厘米左右。然后，按原线抽出。同上。二、细菌的分布细菌种类繁多，繁衍迅速，分布广泛。不论空气、土壤、水、食物、各种物体和器械的外表，以及动物和人体与外界相通的腔道中都有细菌存在。因此，了解细菌在自然界及正常人体中的分布，对于在医疗实际与某些科学实验中树立无菌观念有着重要的意义。(一)空气细菌的检查资料：普通琼脂平板。方法：将普通琼脂平板置于室内不同地方，翻开盖子，暴露于空气中5-10分钟，盖好，放37温箱，培育24

17、小时。结果：察看平板上菌落的数目。(二)土壤中细菌的检查资料：地表土壤，肉汤培育基。方法：取少量土壤放入肉汤培育基内，37培育24小时。结果：察看细菌生长情况。(三)手指等的细菌检查资料：普通琼脂平板。方法：将手指、钱币、衣物等直接涂于琼脂平板上，留意勿将琼脂外表弄破，37培育24小时。结果：察看平板上细菌生长的情况。(四)口腔中细菌的检查资料：血液琼脂平板。方法：将平皿盖翻开，向血液琼脂外表延续咳嗽二、三次，盖好后，37培育24小时。结果：察看平板上细菌生长的情况。实验四 细菌生长形状及运动察看Observation of bacterial growing state and motili

18、ty一、细菌生长形状察看细菌不同，在培育基上的生长形状也不一样。经过察看细菌生长形状，有助于鉴定细菌。(一)琼脂平板上菌落察看一个细菌在固体培育基上，经过一定时间的生长繁衍之后，所构成的肉眼可见的细菌集团，称为菌落。很多菌落连在一同，融成一片，称为菌苔。由于细菌种类不同，以及培育基的成分不同，构成的菌落特点也不同，可呈现一定的形状、色泽等，有助于鉴别细菌。因此，该当对菌落进展仔细察看。其察看要点如下：1、大小：以直径毫米表示之，1毫米左右为小菌落，2-3毫米为中等大落，3毫米以上为大菌落。2、外形：圆形、卵园形及不规那么形。3、边缘：整齐或不整齐、锯齿状、毛发状等。4、外表：光滑、潮湿皱纹、枯

19、燥等。5、隆起度：扁平、凸起、中心凹陷等。6、透明度：透明、半透明、不透明。7、颜色：无色、白色、黄色等。8、溶血性：在血平板上产生溶血毒素的细菌，可以使培育基中的红细胞破坏溶解。可分为完全溶血，草绿色溶血及不溶血。根据菌落的特点，可分为光滑型S型菌落和粗糙型R型菌落。S型菌落为圆形、边缘整齐、外表光滑、潮湿。R型菌落与之相反。(二)斜面上生长形状察看：可见有均匀一致的菌苔，如有不同的菌落出现，那么阐明污染了杂菌。(三)液体培育基中生长形状察看：未培育前的液体培育基多为清澈透明的。接种细菌培育后，由于细菌种类不同，可有以下三种生长方式：1、混浊：液体变为混浊。2、菌膜：液体廓清，外表有一薄膜。

20、3、沉淀：管底有沉淀物。(四)半固体中生长形状察看：无鞭毛无运动的细菌，以培育后仅沿穿刺线生长，培育基清亮。有运动的细菌，沿穿刺线向外分散，穿刺线模糊不清，培育基混浊。二、细菌运动察看运用不染色标本可察看活细菌的运动和形状，且能防止由于某些染色操作而引起的细菌变形。常用的不染色标本的制备方法有悬滴法、压滴法及暗视野显微镜检查法等。资料：枯草杆菌和葡萄球菌混合菌液、盖玻片、凹玻片、凡士林油及暗视野显微镜。方法：取清洁的凹玻片和盖玻片各一张。涂少许凡士林于凹玻片窝的周围；取一接种环菌液滴 于盖玻片之中央；将盖玻片迅速翻转，盖于凹窝上。轻压盖片，使其固定并密封，防止菌液变干，便于长时间察看。镜检方法

21、：将集光器稍降下，使视野内光线变暗。用低倍镜检出悬滴边缘，然后换高倍镜或油镜察看细菌的形状和运动。枯草杆菌有鞭毛能运动，它们在运动时各向不同方向进展，速度较快，相互间的位移很大，称之为真性运动或固定运动。葡萄球菌没有鞭毛不能运动，但由于受水分子的撞击而呈分子运动布朗氏运动，只在原地颤抖，位移不大。(二)压滴法取混合菌液1-2滴，放于载物玻片中央，小心地把盖玻片放入液滴之上。镜检方法与悬滴方法一样。压滴法比悬滴简单，但标本容易干涸，不能作长时间察看。(三)暗视野显微镜检查法镜检方法将混合菌液直接滴于载物玻片上，加盖玻片，做成压滴标本。在标本未放载物台上之前，调理光源光镜，此时在暗视野集光器的面上

22、可以看到一个光圈，用低倍接物镜来察看光圈并转动集光器上的螺旋，使光圈位于视野正中，在集光器上加镜油一滴。降低集光器，放标本于载物台上，徐徐升高集光器，使油滴与玻片接触，但防止油滴中有气泡产生。用低倍接物镜察看标本。这时可以看到一个光点，升降集光器使光点集中而且光度剧烈，并使光点位于视野正中。在标本的盖玻片上加镜油，改用油浸镜察看。此时应放开接物镜上的虹彩，转动镜筒的调理螺旋，待初步看到物像的轮廓以后，再渐渐减少接物镜上的虹彩，直至视野完全无光，而被检微生物明晰可见。 图2 抛物面型暗视野集光器1、光束 2、遮光板 3、标本 4、射入镜筒光线 注检查牙垢时可先在载物玻片上置生理盐水一滴，参与牙垢

23、少许，盖盖玻片，做成压滴标本进展暗视野检查。【原理】由于活的细菌、螺旋体等体积微小而且半透明，在普通显微镜下不易看清楚，假设用暗视野显微镜，即在普通光学显微镜上安装一个特制的集光器一暗视野集光器图2，其中央为不透明的黑板所遮，光线不能直接通向镜筒，仅可从其周围边缘斜射到载玻片标本上。因光线不直接上升，所以视野背景是暗的。从集光器斜射到细菌等微粒上的光线，由于散射作用而发出亮光，反射到接物镜内。故在强光照射下，可以在黑色的视野中看到发亮的菌体。犹如黑夜的天空，闪烁着点点星光；也正象我们在暗室内，能看见从隙缝漏入的阳光内，有千万颗尘埃微粒腾跃飞舞其中一样。实验五 革兰氏染色法Grams stain

24、一、革兰氏染色法革兰氏染色法是最常用的细菌鉴别染色法。要求同窗必需掌握此项根本技术操作，并了解革兰氏染色法在鉴别细菌上的重要意义。1884年由Gram氏建立，因之得名。关于其原理还不完全清楚，曾有几种不同的解释：1、革兰氏阳性菌细胞壁构造比较致密，肽聚糖层很厚，脂类含量低，酒精不易透入。阴性菌的细胞壁较为疏松，肽聚糖很薄、外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被酒精溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫一碘复合物被酒精溶解提出而致脱色。2、革兰氏阳性菌含有多量核糖核酸镁盐，可与结晶紫和碘结合成大分子复合物，不易脱出。而阴性菌中此物质含量甚少，故易于脱色。3、革兰氏阳性菌等电点pH2-3比革

25、兰氏阴性菌pH4-5为低，在同样pH的染色环境中，阳性菌所带的阴电荷比阴性菌多，故与带阳电荷的结晶紫染料结合较为结实，不易脱色。目前以为，在以上各要素中，细胞壁构造上的差别是最重要的要素。资料：葡萄球菌与大肠杆菌的混合菌液。革兰氏染色液，载物玻片等。方法：1、涂片：先将接种环白金耳用火焰灭菌，用灭菌的接种环取菌液一滴，在载物玻片上涂一个薄而均匀的涂膜，直径约为1厘米。如用纯培育菌做涂片时，应先取一滴生理盐水放于载物玻片上，再取少量纯菌，混于盐水中，然后再涂片。2、枯燥：放空气中自然枯燥，或于火焰上部略加烘烤，使液体枯燥。3、固定：将玻片从火焰中央部，反复经过三次。使涂片中细菌，固着于载物玻片上

26、，并杀死大部分细菌。4、取结晶紫液滴于涂膜上，染1分钟，水洗。5、用芦戈碘媒染1分钟，水洗。6、用0.4石碳酸复红液脱色复染半分钟，水洗。7、印干后，用油镜察看。结果：经革兰氏染色后，凡染成紫色的的细菌称之为革兰氏阳性菌；凡染成红色的细菌称之为革兰氏阴性菌。表1 常见的革兰氏阳性和革兰氏阴性菌染色性微生物革兰氏阳性菌G+革兰氏阴性菌G-球 菌葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌等。奈瑟氏菌属脑膜炎球菌、淋球菌等。杆 菌能构成芽胞的杆菌炭疽杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、气性坏疽病原菌等、白喉杆菌、抗酸性菌结核杆菌。绝大多数杆菌肠道杆菌、布氏杆菌、鼠疫杆菌、百日咳杆菌等、弧菌。其它微生物真菌螺旋体、立克次氏体

27、、支原体。附：常用细菌染色液的配制(一) 染料酒精饱和液原液的制备：由于染料的纯度不同，用量可有不同。1、美兰酒精饱和液：美兰5-7克+95酒精100毫升2、碱性复红酒精饱和液：碱性复红10克+95酒精100毫升3、结晶紫酒精饱和液结晶紫5克+95酒精100毫升(二) 碱性美兰液：单染色和抗酸染色等用。混合，滤过。美兰原液 30毫升 0.01KOH 100毫升(三) 结晶紫液：革兰氏染色用。亦可用龙胆紫液替代，配法一样。混合，滤过。结晶紫原液 20毫升1草酸铵水溶液 80毫升(四) 芦戈氏碘液：革兰氏染色用。先用几毫升蒸馏水将2克碘化钾溶解，再加1克碘，在碘溶解之后，再加蒸馏水，最后总量为30

28、0毫升。(五) 石炭酸复红液，用于抗染色法和芽胞染色法。混合，滤过。碱性复红原液 10毫升5石炭酸水溶液 100毫升(六)稀释石炭酸复红液：革兰氏染色法及单染色用。将石炭酸复红液用蒸馏水稀释10倍即可。二、特殊构造染色法细菌的特殊构造有荚膜Capsule芽胞Spore、鞭毛Flagellum，特殊构造用普通染色法不易着色，必需用特殊的染色法才干着色。某些细菌的特殊构造的检查，有助于细菌的鉴别。(一) Hisscapsule stain1、涂片、枯燥、固定。2、结晶紫液加温染色1分钟，弃去染色液。3、用20硫酸铜水溶液冲洗。4、印干、镜检。(二) Flagellum stain户田法1、将具有鞭

29、毛的细菌悄然涂于完全无脂的玻片上，自然枯燥。2、用户田氏染色液染色0.5-5分钟，水洗。3、印干、镜检。菌体和鞭毛均染成红色。户田氏染色液的配制：甲液：明矾饱和水溶液 2份混合5石炭酸水溶液 5份20鞣酸水溶液 2份乙液：复红原液 1份甲液、乙液用前混合，过滤(三) Spore stain 1、涂片、枯燥、固定。2、用5碳酸复红液加温染色5分钟，水洗。3、用95%酒精脱色20秒，立刻水洗。4、用碱性美兰吕氏美兰溶液复染1分钟，水洗。5、印干、镜检菌体染成蓝色，芽胞染成红色。实验六 细菌对药物的敏感性与耐药性实验Sensitivity and resistance test of bacteri

30、a on medicine一、细菌的药物敏感性实验简称药敏实验细菌因其种或株的不同，对药物的敏感性也不同。有的在与药物相互作用中还会改动敏感性。因此，临床上测定病原菌对药物的敏感性，对选用抗菌素、磺胺和中草药治疗细菌引起的疾病、发现耐药菌和及时控制感染都有重要的意义。药敏实验有稀释法与分散法。最常用的有试管稀释法和纸片分散法。(一) 试管稀释法资料：青霉素：用无菌蒸馏水配制成50单位/毫升。菌液：金黄色葡萄球菌6小时肉汤培育物，用肉汤稀释十倍使其浓度约为3亿菌体/毫升。肉汤培育基。无菌小试管，无菌1毫升吸管。方法：1、取无菌小试管15支陈列于试管架上，第1管内参与肉汤1.8毫升，第2-15管内

31、各参与肉汤1毫升。2、第1管内参与抗菌素青霉素0.2毫升，混匀后吸出1毫升加到第2管中。按此法依次作倍量稀释直至第14管，吸出1毫升弃去；第15管不加抗菌素作为对照。3、在上述各试管中，用无菌吸管参与葡萄球菌稀释液0.1毫升。混匀后置37温箱内，培育18-24小时察看结果。结果：试管中肉汤呈均匀混浊，阐明有菌生长即与对看管一样。如肉汤廓清，那么细菌受抑制，抑菌生长之最低抗菌素浓度，即细菌对该抗菌素的敏感度，用单位或微克/毫升表示之。(二)纸片法资料：从病人脓汁中分别出并鉴定为金黄色葡萄球菌。各种抗菌素滤纸片：市售的抗菌素滤纸片上海第六人民医院检验组制，每枚滤纸片的含药量为：青霉素为1单位，其它

32、抗菌素为10微克g磺胺为100微克g,痢特灵为5微克g。普通琼脂平板，无菌镊子及接种环等。方法:1、用灭菌的接种环取纯培育的葡萄球菌少许，经反复划线使之均匀地分布在琼脂外表。2、用灭菌的小镊子，将含药滤纸片于平板的外表，并悄然地压紧。每个平板可贴4-5种滤纸片，其间距为2-3厘米。3、置37温箱内培育18-24小时，察看结果。结果：细菌如对抗菌素敏感，那么在滤纸片的周围出现抑菌环。测定抑菌环直径的大小毫米即可知其敏感性。本实验敏感度参照下述规范断定：抑菌环直径在15毫米以上为高度或极度敏感；10-14毫米为中度敏感；10毫米以下为低度敏感；无抑菌环为不敏感耐药。二、细菌R质粒接合转移实验在细菌

33、的变异中，以药物从敏感变成耐药也是经常发生的一种生物学景象。细菌的耐药基因位于染色体上或R质粒。有些耐药的细菌，特别是肠道杆菌，带有可传送的耐药性质粒resistance plastid ,R质粒，这种耐药性质粒DNA可经细菌接合，由供体菌转移给受体菌，使受体菌也获得相应的耐药性。资料：图3 Cm+Rif伊红美兰平板接种菌表示图1、供体菌为多重耐药的痢疾杆菌D15株，Smr、Cmr、Tcr耐链霉素、氯霉素、四环素。2、受体菌为大肠杆菌K12W1465株，Rifr耐利福平。3、肉汤培育基、伊红美兰平板或中国兰平板、含Cm20g/ml，Rif100g/ml的伊红美兰平板或中国兰平板。方法：1、细菌

34、活化(1) 将供、受体菌分别接种于伊红美兰平板上，37过夜。(2) 分别将两种菌转种于1ml肉汤中，37培育5-6小时。2、接合(1)汲取供、受体菌液各0.02ml于0.5ml肉汤中混匀，37水浴中接合2小时。(2)在含Cm+Rif的伊红美兰平板上按图3涂布接合菌、受体菌和供体菌各0.05ml，置37培育过夜。结果：在Cm+Rif伊红美兰或中国兰平板上，供、受体菌均不生长，只需接合菌长出较大、不透明的黑紫色或兰色菌落。附：噬菌体的特异性溶菌实验噬菌体bacteriophage是细菌的病毒，它可以使相应的细菌溶解，这种溶解作器具有高度特异性，故可用于细菌的鉴定和细菌分型。此外，由于噬菌体可作为一

35、种DNA片断的载体，把某些基因带到宿主细胞中去与DNA整合，引起后者发生变异，目前噬菌体已成为研讨分子生物学的一种重要工具。资料：痢疾杆菌培育物与相应的噬菌体，伤寒杆菌的噬菌体，营养琼脂平板培育基。方法：1、取一接种环痢疾杆菌致密划线于营养琼脂平板上。2、用吸管滴加痢疾杆菌的噬菌体一滴，滴于平板的一端，倾斜平板，使噬菌体液沿与划线垂直方向流下。3、用吸管滴加伤寒杆菌的噬菌体液一滴于平板另一端，倾斜平板，使噬菌体液沿与划线垂直方向流下。4、37培育18-24小时后察看结果。结果：有痢疾杆菌噬菌体处细菌被溶解，无细菌生长；而有伤寒杆菌噬菌体处，细菌不被溶解，细菌仍生长良好。 实验七 脓汁中化脓性球

36、菌的分别与鉴定(综合性实验)(Isolation and identification of phylogenic coccus in pus)在脓汁中常可检出金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、乙型链球菌与肺炎球菌等化脓性球菌，此外也可检出杆菌如大肠菌，变形杆菌、结核杆菌，枯草杆菌等。本实验是用脓汁资料检查金黄色葡萄球菌。资料：1、标本：脓汁2、培育基：血平板、甘露醇发酵管。3、家兔血浆、生理盐水、玻片、革兰氏染色液一套。方法：(一) 化脓性球菌的检查程序。革兰氏染色镜检G+葡萄串状陈列致病性鉴定甘露醇发酵血浆凝固酶G+链状陈列透明溶血环无溶血环草绿色溶血环丙链甲链胆汁溶菌实验菊糖发酵实验奥普托欣

37、实验小鼠毒力实验G+锋芒状成双陈列草绿色溶血环分别培育G-肾构成双陈列生化反响鉴别生长血清学凝集实验菌落察看G染色标 本脓汁直接涂片纯培育乙链纯培育(二)致病性葡萄球菌分别与鉴定1、直接涂片：G染色察看形状、陈列及染色性，初报结果。2、分别培育：脓汁经三区划线接种于血平板上，置37温箱培育18-24小时，取可疑菌落接种于斜面培育基进展纯培育。3、致病性鉴定：甘露醇发酵实验：取纯培育物接种于甘露管中，37孵育18-24小时后察看结果。血浆凝固酶实验：采用玻片法。在玻片两端各滴一滴生理盐水，取少许纯培育物与之混匀成菌液。在一端参与兔血浆一滴混匀，另端不加兔血浆作对照。立刻察看结果，出现颗粒凝集者为

38、阳性，无凝集者为阴性。结果断定：根据上述分别与鉴定结果综合断定。PAGE 1实验八 抗链球菌溶血素“O实验(Anti-streptolysin “O test)乙型溶血性链球菌能产生溶解人或家兔红细胞的溶血毒素“O，此毒素具有很强的抗原性，人受溶血性链球菌感染后，经2-3周即可产生抗溶血毒素“O的抗体。此抗体可以中和溶血毒素“O，此抗体常在病愈后数月至年余才消逝。因此凡检出病人血清中抗溶血毒至少“O抗体效价显著增高时，可以以为病人最近受过溶血性链球菌感染或反复受过溶血性链球菌的损害，如风湿热及急性肾小球肾炎等。本实验简称为抗“O实验。有间接凝集法和中和法两种方法。一、抗“O实验-间接凝集法资料

39、：1、待检血清、阳性与阴性控制血清2、溶血毒素“O溶液3、ASO胶乳试剂4、反响板、试管、吸管或加样器方法：1、将待检血清用生理盐水稀释成1：50，经5630分灭活后待用。2、在反响板上分别滴加1：50待检血清、阳性及阴性控制血清各一滴，再各滴加一滴溶血毒素“O溶液。悄然摇2分，充分混匀。3、各滴加一滴ASO胶乳试剂，20室温下轻摇8分钟。有明晰凝集者为阳性，反之为阴性。4、阳性者，再将血清稀释成1：80，反复操作，有明晰凝集者为强阳性。结果断定：1、强阳性者ASO833单位；2、阳性者ASO500单位；3、阴性者ASO250单位。该实验阳性，可作为风湿热、急性肾小球肾炎等链球菌感染有关疾病的

40、辅助诊断。二、抗“O实验_中和法资料:1、待检血清，1红血球悬液。2、溶血素“O和复原剂亚硫酸钠。3、生理盐水、0.4枸橼酸钠盐水。4、采血针、小试管、吸管等。方法：1、待检者耳垂消毒后针刺取血0.1毫升，放入0.9毫升0.4枸橼酸钠盐水中。室温静置或离心使血细胞下沉，上清液即为待检血清按1：20计算。管底的血细胞再混悬于5毫升生理盐水，即成为1红细胞悬液。2、取溶血素“O及复原剂各一片，置于小试管内，加生理盐水1毫升，用玻璃棒搅碎后，在室温放置15分钟，使溶血素“O恢复活力。即致活溶血毒素“O。最后补加盐水9毫升即可。3、按下表将患者血清倍量稀释，并添加致活的溶血素“O，进展实验。弃去0.5

41、试 剂 1 2 3生理盐水 0.9 0.5 0.5患者血清1：20ml 0.1 0.5 0.5血清稀释倍数 1：200 1：400 1：800致活溶血素“Oml 0.25 0.25 0.251细胞置37水浴15分钟0.25 0.25 0.25置37水浴45分钟后察看结果结果：溶血者液体呈鲜红色，液体廓清，不溶血者液体浑浊。完全不溶血的血清最大稀释度即为该血清的抗“O效价。例如溶血的结果为1：200-1：400-，1：800+，那么效价为1：400，亦称为400单位。目前临床规范是1：200以下为阴性，1：400以上为阳性。实验九 粪便标本中致病性肠道杆菌的 分别鉴定综合性实验与肥达氏反响(Is

42、olation and identification of pathogenic enterobacteria in stool and widal reaction)肠道杆菌是一群生物学性状类似的革兰氏阴性杆菌。普通以其生化反响和血清学反响作为鉴定根据。肠道杆菌的检查在检查水质污染，食品卫生检验及消化感染性疾病的方面均有很大意义。资料：标本：病人粪便。培育基：SS琼脂平板及伊红美兰琼脂平板，半固体双糖铁培育基、蛋白胨水，尿素培育基。其它：吲哚试剂，沙门氏菌多价血清，痢疾杆菌多价血清、玻片、生理盐水等。方法：1、粪便的细菌分别和鉴定程序：粪便标本增菌培育基SS琼脂、伊红美兰琼脂培育基取可疑菌落

43、革兰氏染色双糖培育基生化反响血清学鉴定用分区划线法将粪便接种至SS琼脂平板或伊红美兰琼脂平板上，置37温箱中培育18-24小时，取出察看菌落及供进一步实验用。2、肥达氏反响肥达氏反响系用知沙门氏菌抗原测定病人血清未知抗体的凝集实验，临床上常用以诊断伤寒病和副伤寒病。资料：1、标本：病人血清未知抗体。2、知抗原：伤寒“H及“O、副伤寒甲及乙的“H诊断菌液。3、其他：生理盐水、大试管、小试管、无菌吸管1毫升及5毫升、56水浴箱、试管架等。方法：1、取试管24支。于试管架上排成四排、每排6支，各排之第一管分别标明“TO伤寒杆菌菌体抗原，“TH伤寒杆菌鞭毛抗原“PAH副伤寒杆菌甲鞭毛抗原“PBH副伤寒

44、杆菌乙鞭毛抗原。2、取大试管一支参与生理盐水3.8毫升及病人血清0.2毫升混匀，使之成1：20稀释液。3、取上面稀释好的血清2毫升，分别向各排的第一管各加0.5毫升。4、于大试管中剩余的2毫升。稀释血清中再参与生理盐水2毫升，混匀后即成1：40稀释液。5、取1：40稀释液2毫升分别参与各排第二管中，每管0.5毫升。如此类推。延续稀释血清，分别参与各排的第三管至第五管。第六管不加血清，参与生理盐水0.5毫升作为抗原对照。血清稀释法见下表：资料盐水3.8ml盐水2 ml盐水2 ml盐水2 ml盐水2 ml对看管血清0.2ml第一排TH第二排TO第三排PA第四排PB血清稀释 度0.5ml0.5ml0

45、.5ml0.5ml第一管1：200.5ml0.5ml0.5ml0.5ml第二管1：400.5ml0.5ml0.5ml0.5ml第三管1：800.5ml0.5ml0.5ml0.5ml第四管1：1600.5ml0.5ml0.5ml0.5ml第五管1：320盐水0.5ml盐水0.5ml盐水0.5ml盐水0.5ml第六管6、参与诊断菌液：于第一排各管参与伤寒杆菌“H菌液0.5毫升。于第二排各管参与伤寒杆菌“O菌液0.5毫升，于第三排各管参与甲型副伤寒“H菌液0.5毫升，于第四排各管参与乙型副伤寒“H菌液0.5毫升，因此各管的血清最后稀释度为1：40，1：80，1：160，1：320，1：640，液体总

46、量为1.0毫升。7、将以上各管在试管架中充分振荡摇匀后放置56水浴中2-4小时，取置室温中过夜次日察看结果。结果察看方法：1、察看结果前不要振摇试管。2、先察看抗原对看管应无凝集，有时可见管底有圆形沉淀，但悄然摇试管仍呈均匀混浊景象，如对看管有凝集，即表示抗原或盐水有问题。3、实验管应按顺序自第一管看起，先不要振摇，将试管举起，察看上面液体的明晰程度、及底部有无絮状凝块。然后轻摇试管、使凝块从底部升起，按液体的清浊，凝块的大小记录。4、“H抗原凝集成絮状，疏松的凝块沉于管底，轻摇即随之升起，且易打碎；“O抗原凝集呈颗粒状，沉于管底，成坚实聚块，轻摇那么不易升起，凝集颗粒较小，不易打碎。5、凝集

47、的强弱依试管上清液的明晰度与凝集颗 粒或絮状片的大小分别+、+、+、+、来作断定，其规范如下：上层液体 管 底 凝 块 判 定廓清透明 大片絮状或大颗粒 +微 混 中等片或颗料 +微 混 絮片或颗粒较少仍可见 +混 浊 絮片或颗料似有似无 +混 浊 抗原沉于管底呈圆形块 6、血清稀释度大，仍可有+凝集者为该血清的效价。7、解释结果时应留意以下各点：病人血清同时与伤寒杆菌、甲型副伤寒杆菌，乙型副伤寒杆菌液发生凝集时，应以效价最高者作为诊断标志，低者系类属凝集反响。凝集效价必需高于正常人的血清，有诊断价值。双份血清，第二份血清效价为第一份血清效价的4倍或更高，有确诊意义。应结合患者病史及临床病症，

48、参考“H与“O的效价做出正确的断定。8、正常值：TO1:80 TH1:160 PAH1:80 PBH1:40实验十 粪便中分别细菌的菌落察看， 生化反响与血清学实验综合性实验Observation of isolation bacterium colony in stool、biochemical relation and serologic test一、菌落察看在SS琼脂和E、M、B琼脂培育基上，如检查的沙门氏菌或痢疾杆菌，那么选取平板上无色半透明光滑潮湿边缘整齐的圆形菌落。而非致病菌，如大肠杆菌在SS琼脂培育基上那么是红色的菌落，在EMB培育基上那么是紫黑色并带有金属光泽的菌落。二、生化反

49、响与其结果的察看在培育基上选择无色半透明较小的可疑菌落，取单个可疑菌落的一半接种半固体双糖培育基每一种标本应挑选2-3个可疑菌落分别接种双糖培育基2-3管，放37培育18-24小时。并在菌落的另一半作革兰氏染色察看能否为革兰氏阴性杆菌。(一) 糖发酵糖发酵实验中细菌能否分解某些糖类，以及分解的情况。实验常用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖五种糖发酵管，管上分别以红、黄、兰、白、黑色标志。方法：将细菌接种于微量发酵管中，37培育18-24小时，察看结果。必要时可培育更长时间再断定结果。结果察看：首先察看细菌能否生长，然后记录糖发酵情况。细菌生长，指示剂变色，阐明发酵该种 糖产酸，记录符号为“+

50、；细菌生长，指示剂变色，微量管中有气泡，阐明发酵该种糖产酸产气，记录为 “ eq oac(,+)；细菌生长，指示剂不变色，表示细菌不分解该种糖，记录为“-。(二) IMViC实验靛基质I、甲基红(m)、VPVi及枸橼酸盐利用C四种实验，常用于鉴定肠道杆菌，合称为IMViC实验。1、靛基质实验Indole test检查细菌能否分解色氨酸产生吲哚。方法：将细菌接种于蛋白胨水中，37培育18-24小时，或更长。结果察看:滴加数滴柯氏试剂于培育基外表，悄然摇动试管，如试剂变为红色那么为阳性，记录为“+；假设试剂呈黄色那么为阴性，记录为“-。2、甲基红实验Methyl red test主要用于鉴别E.c

51、oli和产气杆菌，前者分解葡萄糖产生丙酮酸，不转变为乙酰甲基甲醇，故培育液酸性较强，pH在4.5或4.5以下；后者分解葡萄糖产生的丙酮酸脱羧，生成中性乙酰甲基甲醇，培育液pH较高，在4.5或4.5以上。方法：将细菌接种于葡萄糖蛋白胨液体培育基内，37培育48小时。结果察看：滴加甲基红试剂3-5滴。蛋白胨水呈红色，表示pH在4.5或以下，记录为“+；呈黄色表示pH在4.5以上为阴性，记录为“-。3、V-P实验Voges-Proskauer test主要用于鉴别E.coli和产气杆菌。方法：将细菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，37培育48小时。察看结果于培育基中滴加等量的40KOH溶液含有0.3肌酸，培

52、育液变成红色表示实验为阳性，记录为“+，培育液不变色表示实验为阴性，记录“-。产气杆菌分解葡萄糖产生乙酰甲基甲醇，在碱性溶液中被空气中的氧所氧化，生成二乙酰，二乙酰再与培育基中的胍基化合物发生反响，生成红色化合为阳性，记录为“+；E.coli那么否，为阴性，记录为“-。4、枸橼酸盐利用实验Utilization of citrate主要用于鉴别E.coli和产气杆菌。方法：将细菌接种于枸橼酸盐培育基上，37培育48小时。结果察看：某些细菌如产气杆菌能利用枸橼酸盐作为碳源，分解枸橼酸盐生成碳酸盐，使培育基变为碱性，培育基中指示剂BTB由浅绿色转为深蓝色，为枸橼酸盐利用实验阳性，记录为“+E.co

53、li不能分解枸橼酸盐，培育基颜色不变，为阴性，记录为“-。(三) 硫化氢产生实验Production of H2S检查细菌能否分解胱氨酸等含硫氨基酸产生硫化氢。硫化氢遇醋酸铅或硫酸亚铁，构成黑褐色的沉淀物。方法：将细菌穿刺接种于醋酸铅培育基中，37培育18-24小时。结果察看：如沿穿刺线呈黑褐色那么为阳性，记录为“+；假设无变化，那么为阴性，记录为“-。(四) 纯培育：将经初步鉴定的菌落其他部分、进展双糖培育基接种、37培育18-24小时后，按表10初步定为何种菌。大肠、埃希氏菌、志贺氏菌属、沙门氏菌属双糖培育结果 葡萄糖 乳 糖 动 力大肠埃希氏菌 eq oac(,+) eq oac(,+)

54、 +沙门氏菌属 eq oac(,+) - +志贺氏菌属 + - -：S.Typhi只+ ：鸡沙门氏菌无动力 ：斜面上的分解乳糖产酸产气气体不可见。三、血清学实验在检测标本中，采用血清学实验主要有试探凝集实验与因子血清鉴定。(一) 试探凝集实验：取可疑菌落与沙门氏菌属O多价混合血清或多价痢疾杆菌免疫血清做玻片凝集反响，察看凝集与否。根据上述结果可初步断定该菌落能否能够为沙门氏菌属细菌，或痢疾杆菌属细菌，以便进一步检查。(二) 因子血清鉴定：1、如可疑菌株培育物与AF群沙门氏菌多价抗“O血清凝集，再选有组特异性的O因子血清见表分别进展凝集实验。主要沙门氏菌属抗原构造表H抗原第一相 第二相群 O 抗

55、 原 A 甲型副伤寒菌 1、2、12 a B 乙型副伤寒菌 1、4、5、12 b 1、2鼠伤寒杆菌 1、4、5、12 i 1、2 C 丙型副伤寒菌 6、7、vi c 1、5猪霍乱杆菌 6、7 c 1、5 D 伤寒杆菌 9、12、vi d 肠炎杆菌 1、9、12 g、m E 鸭沙门氏菌 3、10 eh 1、62、用沙门氏菌属各群特有的单价抗“O因子血清(2、4、6、9)作玻片凝集反响，断定其属于沙门氏菌属中何组。3、用该族内各菌所持有抗“H因子血清第一相作玻片凝集反响，可最后断定为何种菌。4、新分别的伤寒杆菌丙型副伤寒杆菌菌株常只与Vi血清凝集，而不和抗“O血清凝集。如将培育物加10030分钟破

56、坏Vi抗原即可与多价抗“O血清和因子血清凝集。5、与AE群多价抗“O血清凝集，而与各抗“O因子血清却不凝集的菌株有时能够属于副大肠杆菌如亚利长春市那或枸椽酸盐菌。这部分菌株与沙门氏菌具有亲密联络，不仅某些生化反响极类似，而且带有与沙门氏菌一样的抗“O和抗“H抗原。附录一：(一) 伊红美兰EMB琼脂培育基EMB agar plate成分：蛋白胨 10g磷酸氢二钾 2g琼脂 20g20乳糖溶液 50ml2伊红溶液 20ml0.5美兰溶液 20ml蒸馏水 1000ml制法：1、将蛋白胨和磷酸氢二钾加温溶化于蒸馏水中。2、校正pH值为7.6，参与琼脂。3、煮沸溶化、滤过、分装于三角烧瓶中，每瓶定量分装

57、。4、15磅30分钟高压灭菌备用。5、以无菌手续按量参与经10磅20分钟高压灭菌的乳糖、伊红和美兰，混匀后倾注平皿备用。用途：为分别肠道病原菌的选择培育基。原理：大肠杆菌能发酵乳糖产酸，使伊红与美兰结合成紫黑色化合物，故其菌落呈紫黑色，并有金属光泽。不发酵乳糖的细菌多为病原菌菌落无色透明。此二种染料还有抑制革兰氏阳性菌生长的作用。(二) 沙门氏志贺氏菌属琼脂培育基SS agar plate成分：牛肉膏 5g 蛋白胨 5g 乳糖 10g 胆盐 8.5g 枸椽酸钠 8.5g 硫代硫酸钠 8.5g 琼脂 20g 枸椽酸铁 1g 0.1煌绿溶液 0.33ml 1中性红溶液 2.5ml 蒸馏水 1000

58、ml制法：1、将以上各成分，除琼脂、中性红、煌绿外，加热溶于蒸馏水中，校正pH为7.6。2、参与琼脂，煮沸溶化，滤过，再参与煌绿和中性红溶液，分装于三角烧瓶中，置于流通蒸汽灭菌器内，10030分钟灭菌。3、取出摇匀，倾注平皿备用。用途：为分别肠道病原菌的选择培育基。原理：SS琼脂为强选择性培育基，其中肉膏、蛋白胨为主要营养物质。煌绿、胆盐、硫代硫酸钠、枸椽酸钠等可抑制非病原菌生长，而胆盐可促进某些病原菌生长。大肠杆菌分解乳糖产酸，使中性红为红色，而酸与胆盐结合成胆酸，因此大肠杆菌菌落为中心混浊的深红色菌落，病原菌不分解乳糖，故菌落透明，略带微黄色，枸椽酸铁能指示硫化氢的产生，故产生硫化氢的细菌

59、菌落中心呈黑色。硫代硫酸钠有缓和胆盐对志贺氏菌及沙门氏菌的有害作用，并能中和煌绿、中性红的毒性，且能使大肠杆菌的红色菌落颜色鲜明。(三) 双糖培育基成分：底层甲液：蛋白胨水pH7.4 100ml琼脂 0.4g2酸性复红溶液 0.5ml10葡萄糖液 2ml斜面乙液：2酸性复红溶液 0.5ml20%灭菌乳糖溶液 5ml制法：1、按常规将底层与斜面培育基分别做好。2、将底层部分分装试管中，每管2-3ml。10磅20分钟高压灭菌，冷却后直立使之凝成高层。3、斜面部分盛于烧瓶中，10磅20分钟高压灭菌。4、无菌操作将斜面部分参与小试管底层培育基之上，斜放使之凝成斜面备用。用途：肠道细菌初步鉴定。附录二：

60、1、糖发酵的制备方法：在蛋白胨水中加0.5-1的糖常用的有葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖等。再加一定量的指示剂，分装于毛细管中，火焰封好，10磅20分钟高压灭菌、备用。2、常用指示剂PH敏感范围见表常用指示剂pH敏感范围 指示剂种类 敏感范围 颜色变化酚红Phenot red 6.8-8.4 黄红溴麝香草酚Bromthymot btue 6.0-7.6 黄兰溴甲酚紫Bromcreol purple 5.2-6.8 黄紫甲基红Methyt red 4.4-6.0 红黄中性红Neutral red 6.8-8.0 红黄3、柯氏试剂的制备：对二甲诺氨苯甲醛 5g戊醇或丁醇 75ml 混合溶解浓盐