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文档简介

1、乳酸脱氢酶活力测定原理乳酸脱氢酶lactate dehydrogenase，简称LDH广泛存在于动物、植物及微生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化如下反响： LDH 乳酸 +NAD+ 丙酮酸+NADH+H+LDH可溶于水或稀盐溶液，可制备组织匀浆，经浸泡、离心，得上清为组织提取液。LDH测定方法很多，紫外分光光度法最为简便快速。鉴于NADH和NAD+在340nm和260nm处有各自最大吸收峰值，因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值的改变，定量测定酶的含量。本实验反响液中含丙酮酸及NADH，在一定条件下参加一定量酶液，观察NADH在反响过程中340nm处光吸收

2、减少值，减少越多，那么LDH活力越高。其活力单位定义为：在25 ，条件下A340nm/min下降为的酶量为1个单位。可定量测定每克湿重组织中LDH单位，定量测定蛋白质含量即可计算比活力U/mg。试剂与器材材料：动物的肌肉、肝、心、肾等组织。匀浆缓冲液：磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液。酶活力测定试剂：1磷酸缓冲液 (PB)100ml；2NADH溶液：纯NADH以稀释。3丙酮酸溶液：丙酮酸钠，以以稀释。试剂23最好在临用前配制。操作方法一制备肌肉匀浆二LDH活力测定三蛋白质含量测定四数据处理一制备肌肉匀浆取瘦猪肉或兔肉一块除去脂肪及筋膜等，称取20g，按W/V=1/4比例参加4预冷的磷酸氢二钾-磷酸

3、二氢钾缓冲液，用组织捣碎机捣碎，每次10s，连续3次。将匀浆液倒至烧杯中，置4冰箱提取过夜，过滤后的红色液体为组织提取液，量总体积。二LDH活力测定实验时预先将丙酮酸溶液及NADH溶液放在25 水浴中预热。取2只光径为1cm的石英比色皿，在一只比色皿中参加磷酸盐缓冲液3ml，置紫外分光光度计中，于340nm处调A值为0；另一只比色皿用于测定LDH活力，依次参加丙酮酸溶液、0.1ml NADH溶液，加盖摇匀后测定A340nm，然后参加经稀释20倍的酶液10l，立即计时，每隔测A340nm，连续测定3min。以A对时间作图，取最初线性局部，计算 A340nm/min减少值。三蛋白质含量测定将组织提

4、取液稀释适当倍数约1：20，取0.1ml按Folin-酚法测定蛋白质含量。四数据处理每毫升组织提取液中LDH活力单位：LDH比活力 总LDH活力U比活力U/mg= 总蛋白含量mg A340nm/min 稀释倍数LDH活力单位U/ml提取液= 酶液参加量 10l 10-3提取液中LDH总活力单位= LDH活力U/ml 总体积本卷须知1、实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即用，应贮存在-20 低温冰箱中。2、酶液的稀释度及参加量应控制A340/nm下降在之间，以减少实验误差，参加酶液后应立即计时，准确记录每隔0.5min A340下降值。3、NADH溶液应在临用前配制，如其纯度为75%，那么应折合到100

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