DB32-T 3762.10-2020新型冠状病毒检测技术规范 第10部分：微量血清中和试验-（高清现行）

1、ICS 11.020C 62DB32江苏省地方标准DB 32/T 3762.102020新型冠状病毒检测技术规范第 10 部分：微量血清中和试验Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 10: Serum microneutralization test2020 - 07 - 29 发布2020 - 07 - 30 实施江苏省市场监督管理局发 布DB32/T 3762.102020I前言DB32/T 3762新型冠状病毒检测技术规范目前分为以下部分：第1部分：生物样本采集、运输和保存；第2部分：病毒分离与鉴定；第3部分：核酸荧

2、光PCR检测程序；第4部分：重组酶介导等温扩增程序；第5部分：血清IgM和IgG抗体酶联免疫吸附检测程序；第6部分：血清IgM和IgG抗体胶体金免疫层析检测程序；第7部分：空气样本检测与评估；第8部分：物体表面检测与评估；第9部分：医务人员职业暴露检测与评估；第10部分：微量血清中和试验；第11部分：全基因组高通量测序。本部分为DB32/T 3762 的第10部分。本部分按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本部分由江苏省卫生健康委员会提出。本部分由江苏省卫生标准化技术委员会归口。本部分起草单位：江苏省疾病预防控制中心、南京医科大学、苏州第五人民医院、苏州大学附二院、 昆山市疾病预防

3、控制中心。本部分主要起草人：葛以跃、崔仑标、迟莹、郭喜玲、陈银、朱宝立、程军平、钱志远、罗晓明、 沈欢喜。DB32/T 3762.102020 PAGE 4新型冠状病毒检测技术规范 第 10 部分：微量血清中和试验范围本部分规定了新型冠状病毒微量血清中和试验环境与设施、设备与耗材、试剂与材料、操作步骤、 结果判定和清场与消毒。本部分适用于新型冠状病毒实验室微量血清中和试验。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。新型冠状病毒实验室生物安全指南 中华人民共和国国家卫

4、生健康委员会术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1微量血清中和试验 serum microneutralization test将病原体及其产物（毒素）与免疫血清相混合，在体内或体外检测其致病力的试验，用以检查动物 的免疫状态，测定抗原滴度，以及病原鉴定等。3.2细胞病变效应 cytopathic effect，CPE病毒在宿主细胞内大量增殖，导致细胞病变甚至死亡的现象。大多数病毒感染敏感细胞培养都能引起其显微镜下表现的改变，如细胞聚集成团肿大圆缩脱落及细胞融合成为多核细胞，细胞内出现包涵体， 乃至细胞裂解等。3.3半数组织培养感染剂量 median tissue culture infe

5、ctive dose (TCID50)能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡所需的病毒量，用以表征病毒的滴度。环境与设施实验室资质及级别要求应符合新型冠状病毒实验室生物安全指南的要求，病毒培养包括病毒的分离、培养、滴定、中和试验等实验操作应当在生物安全三级实验室（BSL-3）的生物安全柜内进行。实验室开展相关活动 前，应当报经国家卫生健康委批准，取得开展相应活动的资质。操作人员资质及防护要求实验操作人员应经过生物安全培训并取得BSL-3实验活动上岗证，在身体健康状态良好的情况下经 实验室主任批准后方可开展活动。操作人员应根据新型冠状病毒实验室生物安全指南要求，按照BSL-3个人防护的要求进

6、行防护。设备与耗材设备生物安全柜、离心机、倒置显微镜、涡旋器、冰箱、CO2培养箱等。耗材N95及以上防护口罩、医用无纺布帽、护目镜、连体防护服、一次性PE手套、一次性手术衣、乳胶 手套、防水靴套、微量移液器及各种配套带滤芯Tip头、一次性平皿、离心管、96孔细胞培养板等。试剂与材料试剂Hanks 溶液（每毫升含青霉素、链霉素各 2000 单位）DMEM 培养液（含 10%胎牛血清）。DMEM 维持液（含 2%胎牛血清）。消化液 （0.25%胰酶和 0.025% EDTA-Na2 混合液）。材料已滴定的新型冠状病毒悬液。阳性对照血清、阴性对照血清（正常血清）及待检血清。非洲绿猴肾传代细胞（VER

7、O-E6）、人呼吸道上皮细胞、人肝癌细胞（Huh7）或其它敏感细胞。试验技术要点确定实验室质量控制标准的新型冠状病毒病毒株滴度，应至少有三次独立的滴度水平测定结果， 三次实验结果的滴度波动不应超过+/-0.5。中和抗体滴度的判定是以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，因此设置对照实验十 分重要。采用固定病毒稀释血清的方法进行微量中和试验。操作步骤实验前准备将实验所需细胞置 37 5% CO2 培养箱培养至单层，在进入 BSL-3 接种病毒前，弃掉细胞培养液，用 Hanks 溶液洗 3 次。配备消毒液：75%乙醇、有效氯 5500 mg/L 的含氯消毒液。将细胞、病毒、血清、试剂和耗材一

8、次性带入 BSL-3 核心区。血清稀释血清的处理：将待测血清、阳性对照血清及阴性对照血清 56 水浴灭活 30 min，为防止管盖崩开，要用封口膜封管口。待冷却后移至生物安全柜内进行稀释。在生物安全柜里，将待测血清、阳性对照血清及阴性对照血清用 DMEM 维持液做倍比稀释， 使其稀释度分别为 1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128，每管量为 0.5 ml。每一稀释度必须更换吸头，吹打混匀。病毒稀释在生物安全柜里，用 DMEM 维持液稀释病毒至 100TCID50/0.1ml。血清与病毒结合在上述各稀释的血清管内加 0.5 ml 病毒稀释液（100TCID50/0.1ml ），

9、充分混匀，拧紧管盖， 用封口膜封口后置 37水浴 1 h。病毒对照为 0.5 ml 病毒稀释液（100TCID50/0.1ml ）加 0.5 ml 的维持液，同样用封口膜封口后置 37水浴 1 h。正常细胞对照不加病毒，仅含 DMEM 维持液。接种细胞弃去细胞培养孔中的 Hanks 液。将每个稀释度的血清病毒混合物接种到单层细胞上，每一稀释度接种 4 孔，每孔 0.2 ml。将接种好样品的 96 孔培养板置 37 5% CO2 培养箱中培养。结果观察每24 h在倒置显微镜下观察细胞形态变化（CPE），并记录结果，观察5 d7 d，以0%25%细胞CPE变化为“+”，26%50%细胞CPE变化为

10、“+”，51%75%细胞CPE变化为“+”，76%100%细胞CPE变化为“+”，正常细胞形态为“-”。以病毒对照出现“+”时，结束试验。结果判定质控要求正常细胞对照孔应该有完整的细胞单层，病毒对照孔应出现“+”的CPE变化；能够阻止产生CPE的阳性对照血清可以中和病毒的感染性，故阳性对照血清孔应无CPE，与正常细胞对照孔相同； 阴性对照血清孔的CPE情况应与病毒对照孔相同。50%血清中和终点的计算50% 血清中和终点为能保护50% 细胞不产生病变的血清最高稀释度， 即为中和终点， 可按Reed-Muench法计算结果，参见表1。表 1 某新型冠状病毒病人恢复期血清 50%血清中和终点的计算血

11、清稀释度细胞病变管数/总管数细 胞 病变分布累计阳性比例阳性率（%）（+）管（-）管（+）（-）1:4 （10-0.6)0/4040160/1601:8(10-0.9)0/4040120/1201:16 (10-1.2)0/404080/801:32 (10-1.5)1/413141/5201:64 (10-1.8)3/431414/5801:128 (10-2.1)4/440808/8100注1：计算公式为：lg50%血清中和终点=b+dc, b为小于50%阳性率血清稀释度的对数，d为距离比例，c为稀释系数的对数，其中d=（50小于50%的阳性率）/（大于50的阳性率小于50%的阳性率）。注2：本例中：d= (5020)/(8020)0.5，lg50%血清中和终点=-1.5+0.5(-0.3)=-1.65，-1.65的反对数为1:45，既1:45的血清可保护50%细胞不产生病变。清场与消毒操作结束后，及时清理生物安全柜内的物品，用 75乙醇擦拭外表面后，