2 通过泛素蛋白酶体降解调节FOXO蛋白稳定性

1、通过泛素蛋白酶体降解调节FOXO蛋白稳定性摘要：叉头框O族（FOXO）蛋白是经历进化过程而保存的转录因子。在人类中，它们属于由FOXO1,FOXO3a,FOXO4和FOXO6组成的蛋白家族。越来越多的证据表明，FOXO蛋白通过在转录水平调控基因表达，起到抑制肿瘤的作用，如：抑制细胞周期、凋亡、DNA修复和抵抗氧化应激等。在人类原代肿瘤和肿瘤细胞株中，包括Akt、IKB激酶（IKK）和ERK等在内的多种蛋白激酶的活化，导致FOXO蛋白磷酸化，并通过E3连接酶如SKP2、MDM2的介导而泛素化。从而导致FOXO蛋白被泛素蛋白酶体系统降解，从而失去或削弱了抗肿瘤功能，使细胞的转化、增值和生存更加便利

2、。因此，FOXO蛋白的泛素化和降解在肿瘤发生中起到关键的作用，并在癌症治疗方面表现出可利用的价值。1.引文对于人类肿瘤谱中的大多数肿瘤而言，它们的“人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因”（PTEN）常常是突变或缺失的。PTEN通过对抗磷酸肌醇3-激酶（PI3K）的作用，其主要功能表现为脂质磷酸酶。PTEN的缺失导致质膜中磷脂酰肌醇（3,4,5）三羟甲基氨基甲烷磷酸盐（PIP3）水平的增加，从而导致蛋白激酶B（PKB或Akt）的活化。Akt通过对下游一系列效应蛋白（包括FOXO转录因子）的活化或去活化的作用，对细胞存活起核心作用。越来越多证据表明，FOXO蛋白通过调节基因表达（包括凋亡

3、、抑制细胞周期、抵抗氧化应激、DNA修复等）而表现抑制肿瘤功能。人类肿瘤细胞中PTEN缺失导致的Akt活化或更本质上的PI3K活化，导致FOXO蛋白的磷酸化和抑制。Akt磷酸化还诱导细胞核通过核孔复合体输出FOXO蛋白，此过程依赖14-3-3伴侣蛋白和输出受体染色体区域维持蛋白1（出核因子1，核输出受体1，CRM1）。因此，由于Akt介导的磷酸化和核输出，依赖核及转录的FOXO蛋白的抑制肿瘤的功能被废除（图1）。2.Akt激活促进FOXO蛋白降解除了Akt介导的FOXO磷酸化以外，Akt激活还促进这些蛋白的降解，并且这一过程被蛋白酶体抑制剂所抑制。在HepG2细胞中，胰岛素能诱导FOXO1蛋白

4、降解,此降解过程需要PI3K/Akt途径介导的FOXO1磷酸化。与此相似的是，FOXO1在缺乏血清的正常小鸡胚胎成纤维细胞中高表达，用血小板衍生的生长因子治疗后，FOXO1蛋白快速磷酸化并降解。而且，在PI3K/Akt途径诱导的癌性转化中，依赖Akt磷酸化的FOXO1蛋白酶体降解起了重要的作用。因此,Akt通过促进FOXO磷酸化和出核，以及诱导FOXO蛋白酶体降解来抑制FOXO的活性。作为Akt的补充，其他激酶如IKB激酶（IKK）和ERK同样能促进FOXO3a的蛋白水解。Insulin.GroMhFactorsAPC:dhlHAU5P/USP7(highlevel)SKP2(branchin

5、gE3)CWQP古VRMdm2(primingE33.SKP2与Akt协同导致FOXO1泛素蛋白水解泛素-蛋白酶体系统（UPS）在蛋白降解中起重要作用。在靶蛋白被蛋白酶体识别及靶定为降解对象之前，通过3种酶的连续活化，泛素被迁移并共价接附到底物蛋白上，这3种酶是泛素活化酶（E1），泛素耦合酶（UBC,E2）和泛素蛋白连接酶（E3）。由于哺乳动物只有一种E1和少量种类的E2,底物蛋白的特异性靶定被认为由E3介导。根据结构相似性，E3连接酶被分为2大家族：环指蛋白家族和HECT结构域蛋白家族。SKP1-CUL1-F-box蛋白（SCF）复合体是一种多亚基的环指E3连接酶，靶定FOXO1。在复合体中

6、，CUL1起到支架的作用，负责招募接合蛋白SKP1和环指蛋白RBX1（图2A）。SKP1则结合到包含F-box的蛋白如SKP2和0-TrCP的F-box区（图2A）。大多数SCF底物蛋白被F-box亚基识别并与之结合。通过特定的区域，如SKP2的亮氨酸富集区（LRR）和0-TrCP的WD40区，SCF复合体特异性识别并结合底物蛋白。由于底物蛋白磷酸化对于SCF复合体靶定底物蛋白是必须的，因此磷酸化的位点通常被称为“磷酸降解决定子”（phosphodegron）。CUL1还能结合环指蛋白RBX1，后者通过其环指区域，招募UBC（E2）至SCF复合体。通过与底物蛋白及E2的结合，SCFSKP2E3

7、复合体能将泛素蛋白转移至底物蛋白上（图2A）。对于多数细胞类型而言，FOXO1受到SKP2的特异性限制。与Akt在FOXO1降解中的作用一致，SKP2结合FOXO1需要后者在其丝氨酸256位点进行Akt介导的磷酸化。SKP2还诱导FOXO1的多泛素化和降解。重要的是，SKP2诱发的泛素依赖性蛋白酶体降解要求FOXO1在其丝氨酸256位点进行Akt磷酸化。因此，像其他被研究地较透彻的SCF0-trcp复合体和SCFSKP2复合体的底物如IKBa，0-连环蛋白及p27KIpi,SKP2识别和结合F0X01需要包含丝氨酸256磷酸化位点的磷酸降解决定子基序。虽然现在并不清楚F0X01中是哪个赖氨酸残

8、基被SCFSKP2特异性靶定而导致泛素化的，但这些残基很可能定位于F0X01的NH2端起始的260个氨基酸中。有趣的是，在包括IKBa，p-连环蛋白及p27KIP1等已知的SCF目标底物中，泛素能识别的赖氨酸常常定位于NH2端至磷酸降解决定子基序之间的区域中的9-14个氨基酸。因此，在F0X01的泛素化和降解两个方面，SCFSKP2靶定F0X01的机制很可能是相似的。BSubstratesUbSubstrateSKP1UbAcceptingLysinesPhospho-degronE3LigaseIkBqP-Cateninp27KlplFOXO14.其他途径对SKP2介导的FOXO1泛素蛋白水

9、解的调节Akt除了诱导FOXO1磷酸化这一SKP2介导的FOXO1泛素化蛋白酶体降解的必须步骤以外，可能还通过其他方法促进FOXO1降解。PTEN的减少导致SKP2mRNA水平的增加，PTEN的这种效果是依赖Akt的。SKP2的水平和稳定性受另一个E3连接酶(第三期促进复合体/细胞周期小体)及其活化剂Cdh1(APC/CCdh1)所调节。Akt在SKP2的丝氨酸72位点将其磷酸化，但是此磷酸化在功能方面的重要性尚无定论。有两例报道认为，此磷酸化促进SKP2的胞质定位，损害细胞核中APC/CCdh1介导的SKP2降解。但是另有报道指出，Akt介导的SKP2丝氨酸72位点磷酸化不影响SKP2的亚细

10、胞定位。此外有证据显示，有条件地敲除胸腺细胞中的核辅助因子CBP,可增加SKP2蛋白水平，促进T细胞淋巴瘤的发展。值得注意的是，除了作为重要的转录辅助激活剂，CBP还是APC/CcdhiE3连接酶的关键功能性组成部分。由此我们可以推测，CBP的缺失影响APC/CCdh1E3的活性，从而促进SKP2的稳定性。重要的是，在CBP敲除的T细胞淋巴瘤中，高水平的SKP2蛋白与低水平的F0X01蛋白呈负相关。SKP2介导的F0X01降解在其他类型肿瘤中也可被观察到。由此，许多癌症相关途径聚焦于SKP2蛋白水平的调节，此调节可能通过泛素蛋白酶体途径影响F0X01蛋白水平。FOXO蛋白的单泛素化和去泛素化单

11、分子环指E3连接酶MDM2促进包括F0X01，F0X03a，F0X04在内的多种FOXO因子的泛素化，提示MDM2是F0X0蛋白降解的总E3连接酶。Ras/Raf途径活化的ERK可导致F0X03a的磷酸化及下调。被ERK磷酸化的F0X03a进一步由MDM2介导而泛素化和蛋白酶体降解。有趣的是，单独敲除或沉默MDM2能升高F0X03a蛋白水平，此效果看来受到MDM2诱导的FOXO蛋白多泛素化的调节，而另外有研究显示，MDM2催化FOXO4多次的单泛素化而不是多泛素化。在培养的细胞应对氧化应激时也能观察到促进其核定位的FOXO4单泛素化。此外，单泛素化的FOXO4能被去泛素酶（疱疹病毒相关的泛素特

12、异性蛋白酶（HAUSP）/USP7）去泛素化。基于上述发现，我们认为:ERK磷酸化的FOXO蛋白，尤其是FOXO3a，可被主线E3连接酶如MDM2单泛素化，从而诱导FOXO蛋白的核定位（图1）。此过程可被HAUSP/USP7介导的FOXO蛋白去泛素化所逆转。在特定条件下如高水平的MDM2,FOXO蛋白被多泛素化（图1）。目前认为单泛素化FOXO蛋白能进一步通过支线E3连接酶如SKP2转变为多泛素化形态。FOXO蛋白酶体降解在细胞转化及肿瘤发生中的作用FOXO蛋白的活化上调基因表达，产生的影响包括抑制细胞周期，凋亡和DNA修复，暗示这些蛋白有抗肿瘤的功能。事实上，在PTEN突变的前列腺和肾脏癌细

13、胞中，强迫表达FOXO1和FOXO3a分别诱导细胞凋亡和抑制细胞周期。这种FOXO1的抗肿瘤效果在SKP2过表达的细胞中被大幅削弱。相反，抗Akt磷酸化的FOXO1突变和SKP2的共同表达，既不能促进突变形态的FOXO1蛋白酶体降解，也不能促进前列腺癌细胞突变诱导的死亡。因此，FOXO1的降解有助于Akt介导的细胞生长和生存，以及SKP2诱导的肿瘤发生。一个以鸡胚胎纤维组织母细胞（CEF）为工作模型的独立研究证明了上述发现，认为PI3K和Akt诱导细胞转化。有趣的是，在PI3K和Akt诱导转化的CEF中，FOXO1表达被抑制，此效果受到PI3K/Akt诱导的FOXO1蛋白酶体降解的调节。值得注

14、意的是，在PI3K/Akt介导的致癌转化中，磷酸化依赖的FOXO1蛋白酶体降解起到很重要的作用。奇怪的是，在某些缺乏Akt磷酸化或活化的乳腺肿瘤中，F0X03a蛋白定位于胞质。IkB激酶（IKK）既调节F0X03a的胞质定位，也能诱导其蛋白酶体降解。此外，在乳癌中，F0X03a的胞质定位既与IKK表达相关，又与低生存率相关。重要的是，在培养的肿瘤细胞和荷瘤小鼠中，IKK的构成表达能促进细胞增殖，但这些IKK的效果能被F0X03a反转。因此，F0X03a的IKK磷酸化同样是促进细胞生长和肿瘤发生的重要机制。另一个明确的癌症相关激酶级联是Ras-MEK-ERK途径，ERK的活化诱导F0X03a的多残基磷酸化。ERK磷酸化的F0X03a能被