2022医学课件大肠杆菌DNA聚合酶1的作用与应用资料

1、大肠杆菌DNA聚合酶 I生物0822 0814151008 肖乐第一页，共十四页。大肠杆菌DNA聚合酶 I的活性5-3DNA聚合酶活性15-3外切核酸酶活性23-5外切核酸酶活性3第二页，共十四页。5-3DNA聚合酶活性 在引物RNA-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApol使DNA链沿5 3方向延伸。 3 Mg2+,dNTP 5 5 3 DNA聚合酶I第三页，共十四页。5-3外切核酸酶活性 从53方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对局部(双链)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是53。 3 Mg2+ 5 5 3 DNA聚合酶

2、I第四页，共十四页。3-5外切核酸酶活性 由3端水解DNA链，反响底物是带3-OH的双链DNA或单链DNA，其活性从3-OH端降解ds-DNA，可被5 3聚合活性封闭，也可被带5磷酸的dNMP抑制 5 Mg2+ Mg2+,dNTP 3 3 5 DNA聚合酶I DNA聚合酶I第五页，共十四页。活性能发生的反响切口平移置换反应活性第六页，共十四页。置换反响 如果只有一种dNTP存在，3 5外切核酸活性将从3-OH端降解DNA，而5 3聚合酶活性又在合成DNA，然后在该位置发生一系列的合成和外切反响，直到露出与该dNTP互补的碱基。 3 5外切酶活性 5 3 5 3聚合酶活性第七页，共十四页。切口平

3、移 首先在镁离子存在下用少量DNaseI处理双链DNA模板，产生少量切口。在切口处利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5-3外切核酸酶活性是切口沿5-3方向移动，同时5-3DNA聚合酶活性又不断合成DNA。 5 Mg2+ DNaseI 3 5 dNTP 大肠杆菌DNA聚合酶I 3 第八页，共十四页。应用13-端的末端标记2切口平移法标记DNA3合成cDNA的第二链第九页，共十四页。3-端的末端标记 先用此酶的35核酸外切酶活性，切除凸出的3-粘端，形成5-凸出粘端；在以其53聚合酶活性使其使其补平，在高浓度dNTP的条件下，3-端的外切反响与dNTP的搀入反响到达平衡。假设dNTP中有放射性标记的核苷

4、酸，即可使产物成为3-末端的带标记的DNA。第十页，共十四页。切口平移法标记DNA 在Dnase的作用的根底上产生连内切口，应用此酶的53聚合酶活性和53外切酶活性的同步联合反响，使切口沿DNA链从5-端向3-端移动。假设用聚合反响的原料dNTP带有放射性核素-32P，就能使生成的双链带有标记物。根据此原理可做DNA杂交探针。第十一页，共十四页。合成cDNA的第二链 单链cDNA3-端可形成发卡结构，便于DNA聚合酶I发挥53聚合酶活性，合成cDNA的第二链。由于其具有5-3外切核酸酶活性，现在已不再用于此应用。第十二页，共十四页。Thank You !第十三页，共十四页。内容总结大肠杆菌DNA聚合酶 I。从53方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对局部(双链)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是53。假设dNTP中有放射性标记的核苷酸，即可使产物成为3-末端