基因的图位克隆

1、 基因的图位克隆 要点1. 克隆基因的意义2. 基因克隆的常用策略及比较3. 图位克隆的基本程序和以 xa13为例介绍图位克隆的详细过程5. 总结及展望1.为什么要克隆基因？ 克隆基因有助于我们解释基因的生物学功能、调控模式、进化关系等。 在植物中，大部分基因的功能未知。Tabata, S. et al. 2000, Nature 408, 796 - 815应用价值： 第二次绿色革命、预设育种等故事向我们展示了可以通过分子标记辅助，利用基因进行作物的遗传改良的光明前景。Gurdev S.Khush.2001,Nature 2:845 分子标记辅助选择的前提是基因的定位或克隆！2.基因克隆的策

2、略: 正向遗传学与反向遗传学 反向遗传学：依赖于从基因组和表达序列标签测序或基因表达谱等的信息，对候选基因的功能进行干扰，从而证明特定序列所控制的表型。 正向遗传学：从已有的相对表型的差异开始，去分离引起表型变化的对应核苷酸序列改变。基因克隆的主要方法： T-DNA标签法：当T-DAN导入植物基因组中，并插入基因的编码区或重要的调控区，即会发生缺失突变的表型，而且会在插入位点一个标签。LI Ai-Hong et al. 2006, Acta Genetica Sinica 33 (4)：312318优点：可以高效快速分离引起表型变化的基因。缺点：1. T-DNA标签法只对特定范围的植物有效；2

3、. 插入突变往往产生基因功能的完全丧失，因此很难分离植物生长发育过程中的必须基因；3. T-DNA插入只能突变一个基因，假如它是一个基因家族的成员，突变基因丧失的功能会被其它成员补偿；4.对于受多基因控制、效应小的基因，T-DNA的插入很难引起表型的改变；4. 很多表型的改变并不一定是由于T-DNA插入引起。Georg J. et al. 2002,Breakthrough Technol.129:440-450Janny L. P. at el.2003.TRENDS in Plant Science l.8:484-491基因的抑制表达：通过降低目的基因在细胞的表达水平，使基因的功能下降甚

4、至消失，来研究基因的功能。基因的超量表达：通过人为的重组DNA手段，在生物体细胞中大量地、持续的表达目的基因，使目标基因的功能得到超常发挥。 优点：目的明确，对由基因家族控制的相关形状，抑制表达能同时降低此基因家族成员的功能；抑制表达和超表达是研究时空表达的有力工具。缺点：抑制表达和超表达会使相关基因的功能紊乱，常常很难判断相关表型的改变是由于目标基因还是由于被紊乱的基因引起的。葛莘. 高级植物分子生物学, 2004 另外还有TILLING技术、芯片技术、比较基因组学、生物信息学都被广泛的应用于基因的克隆。3. 图位克隆和以 xa13为例介绍图位克隆的详细过程原理：在减数分裂时期，同源染色体之

5、间配对，非姊妹染色单体发生交换，与目标基因距离越远，发生交换的频率就越大，距离越近，发生交换的频率就越小（遗传学第三定律）。（王亚馥，戴灼华. 遗传学.1999，第三章：60-76）与基因发生最小交换频率的两侧分子标记，就是与基因最紧密连锁的分子标记，这两个分子标记之间的区段就是包含这个基因的目标区段。常用概念：分子标记：基因组特定区域在亲本之间有多态性的DNA序列，简单说，就是这段DNA序列能够指示基因组特定区域的片段是来自哪个亲本标记基因型：指这段DNA序列所来源的亲本基因组区段基因基因型：控制目标性状的DNA区段ZH. H. Ren et al. 2005, Nature genetic

6、s 37: 1141-1146GS3GN1qSH1xa13Fw2.2群体准备：选择目标性状差异大并且亲缘关系适中的两个亲本构建群体4. 以xa13为例介绍图位克隆的详细过程群体准备：选择目标性状差异大的两个亲本构建F2群体。 IR24为对PXO99高感的一个亲本含有XA13/XA13一对显性基因，IRBB13为以IR24为背景的 xa13/xa13的近等基因系对PXO99高抗。Zhaohui Chu et al. 2006, Theor Appl Genet 112: 455461步骤第一步:构建分子标记为基础的遗传连锁图目的：找到与目标基因紧密连锁的两个分子标记。方法1：对受到多基因控制的数

7、量性状基因或想要定位多种性状的基因，需要构建全基因组的遗传连锁图。方法2：对想要定位一个质量形状或效应特别大的数量形状基因，也可以通过BSA法构建局部遗传连锁图 BSA法：在一个利用F2、BC 、RIL、 DH等群体中随机选择一定数目的某种表型如抗病的个体，提取DNA,构成一个抗性池；再随机选择一定数目的另一种表型如感病的个体，提取DNA组成感病池。这样，抗病池和感病池基因组除了在抗病性位点有差异(有多态性)，在其它位点都是一样的(无多态性）。因此，在抗病池和感病池之间有多态性的标记就是与目标基因连锁的标记。G. Zhang et al等利用IR24和IRBB13杂交，得到的F2分离群体，利用

8、BSA法，找到了一个RAPD标记OPAC05，在抗病池和感病池之间有多态性。从而将 xa13定位于OPAC05附近。 G. Zhang et al. 1996 , Theor Appl Genet 93:65 70利用日本和康奈尔报道的chro8 xa13区段RZ28-RG136之间的8个RFLP和1个STS标记构建了两个群体遗传图。A. C. Sanchez et al. 1999, Theor Appl Genet 98: 1022-1028 后来储朝晖博士，为了验证以上的结果，利用极端隐性分组分析法对来自IRBB13和IR24杂交的250株极端抗病F2单株把 xa13 重新定位于S140

9、03和RG163之间，同时一个新发现的CAPS 标记E6a定位于标记RG136和xa13基因之间，从而以Ea6和S14003作为构建物理图谱的起点。Zhaohui Chu et al. 2006, Theor Appl Genet 112: 455461极端隐性分组分析法： 抗病的单株的基因的基因型为 xa13/xa13，如果在xa13两侧都检测到有来自IR24的标记基因型，则这个两个标记就是基因xa13的边界。第二步：构建包含目标基因的物理图谱用目标区段内的最紧密连锁的两侧的分子标记作为探针筛选文库，再以分离到的克隆的两端作为探针进一步筛选文库，如此往复，直到确认克隆之间的重叠关系, 最终构

10、建覆盖目标基因的两个标记之间的物理图谱。目的：通过对确认的克隆测序测序等进一步开发与目标基因连锁更加紧密的分子标记实现染色体登陆。现在，对于水稻、拟兰芥等已经测序的植物，无须进行物理图谱的构建。对其它的没有完成测序的作物，因为基因组共线性在植物界广泛存在，物理图谱的构建也变的容易了。HindIII-digested 21H14 end-labeled, as a probeHindIII-digested 44F8end-labeled, as a probe用RG163的STS R2027S14003 G1149筛选IR64文库得到四个contigs群，一共11个克隆。分别以克隆42C23的

11、末端序列42C23R为探针和以克隆6B7末端序列6B7F为探针重新筛选文库分别得到以个新克隆33C7和14L3。R2027和S14003的contig群最大的克隆21H14和44F8探针与得到的这13个克隆杂交，最终结合末端测序把这两个重叠群连成一体。A. C. Sanchez et al. 1999, Theor Appl Genet 98: 1022-1028分别以 xa13 两侧的分子标记Ea6和S14003为起点，对MH63基因组文库进行染色体步移，结合BAC指纹图谱分析获得5个相互之间重叠非冗余的克隆同时开发了在这个区段开发了大量的分子标记。根据分子标记S14003筛选的明恢63 B

12、AC克隆44F01，与来自 A. C. Sanchez et al构建的水稻品种IR64的两个BAC克隆21H14和14L03具有相似的DNA指纹图谱。因为MH63IR64都为感病材料，在 xa13区段应该有很高的同源性，结合重组交换 的信息从而确定的xa13所在的BAC。Zhaohui Chu et al. 2006, Theor Appl Genet 112: 455461包含GS3的物理图谱 C.C. Fan et al. 2006, TAG 112:1164-1171包含SCK1的物理图谱 ZH. H. Ren et al. 2005, Nature genetics 37: 1141

13、-1146包含Gn1a的物理图谱 Motoyuki Ashikari et al. 2005, Science 309: 741-745第三步：精细定位扩大F2群体，用紧密连锁的两侧质量好的分子标记对3000-10000个单株将基因定位到较小的区段定位到单基因甚至几百bp。先用目标区段两侧的两个质量好标记对大群体进行重组单株的鉴定，利用这个区段开发出来的标记，对重组单株进行标记基因型的分析，所有鉴定出的重组单株上收获的F3代种子，来鉴定基因型是纯合的还是杂合的，结合标记基因型和基因的基因型把目标基因定位到更小的区段 利用极端隐性个体计算重组率：c=(N1+N2/2)/N N为纯隐性基因型个体总

14、数，N1为标记基因型为纯合且此位点来自显性亲本的隐性表型个体总数，N2为标记基因型为杂合的隐性表型个体总数Q. Zhang 1994, PNAS 91:8675-8679A. C. Sanchez et al. 1999, Theor Appl Genet 98: 1022-1028利用末端测序的结果，在原有的两个标记R2027和S14003附近新开发了42C23R、21H14、6B7F、21H14F四个标记，用第一个群体将 xa13定位于标记R2027和42C23之间，用第二个群体将 xa13定位于21H14和21H14之间。从而最终把xa13 定位到一个克隆21H14上。利用在物理图谱构建

15、过程中开发的标记，利用第二个群体把 xa13 定位于RP7右侧，从而将xa13定位于标记RP7和S14003之间，利用第三个群体把 xa13定位于RP7和ST9的14.3Kb之间。最终把 xa13排除出R2027和RG163之间的区域，即克隆14L03上。利用后代测验，进一步验证这一次定位结果的准确性。Total number of recombi- 10 2 0 2 2 8 ation eventsZhaohui Chu et al. 2006, Theor Appl Genet 112: 455461后来又利用在ST9和RP8之间开发的标记ST12，从F2发现了一个重组单株在ST12与 x

16、a13发生了交换。 Xa13被精细定位在RP7和ST12之间的9.2Kb ，基因预测共发现只含有一个基因。Zhaohui Chu et al. 2006, Genes & Dev. 20: 1250-1255 对于QTL基因，为了检验目标区段的效应，可以将构建好的NIL种下发展成一个随机群体，考察表型，看是否符合3：1分离。C.C. Fan et al. 2006, TAG 112:1164-1171 C.C. Fan et al. 2006, TAG 112:1164-1171第四步：功能验证 证明转基因 供体亲本 在产生的形态学表型 时空表达模式上具有一致性。 例如： 结合候选基因法，1)

17、 通过转基因（通常将显性基因转化突变型材料），抑制或者超表达目标基因，考察目标基因的功能是否与目标形状相同如：功能互补实验，RNAi等实验; 2) 通过比较测序，证明目标形状变化是由于DNA 序列的变异造成的。被精细定位在RP7和ST12之间9.2Kb的 xa13 ，基因预测共发现只含有一个基因，并且GenBank 中来自IR24和IR64的这一区段有很高的同源性，对这个唯一的候选基因进行功能验证。 将来自IR64的BAC克隆14L03的9.2Kb的片段转化IRBB13,在T0代发现，所有含来源于IR64的 Xa13片段的单株，都为高感的；不含来源于IR64的 Xa13片段的单株，都为高抗的。

18、对T0感病的单株来的T1家系分析，基因性和表型完全共分离。T1家系分析Zhaohui Chu et al. 2006, Genes & Dev. 20: 1250-1255Xa13表达水平与抗病性关系A：Xa13抑制表达B：Xa13超表达Xa13时空表达和诱导表达C：Xa13/xa13空间表达模式D： Xa13/xa13在POX99诱导 下时间表达模式结论：表达水平相对低是导致抗病和雄配子育性低下的原因！Zhaohui Chu et al. 2006, Genes & Dev. 20: 1250-1255为了找到导致等位基因功能的变化的根本原因：序列的差异。对除了以前测序的IR24、IR64的

19、Xa13区段，又测了5个感病材料的Xa13区段，组成一个感病组；测了11个抗病材料的 xa13区段，组成一个抗病组。抗病组 Aus274 和 Kalimekri 77-5在xa13区段，与感病组在 Xa13区段编码的蛋白质一样。表明编码区的变异不是导致抗病的根本原因！Zhaohui Chu et al. 2006, Genes & Dev. 20: 1250-1255由于白叶枯病菌株PXO99在相同遗传背景的近等基因系IR24和IRBB13中能诱导显性基因Xa13的增强表达，而不能诱导隐性基因xa13的增强表达，这种差异可能是由xa13和Xa13基因启动子区间的序列差异造成的。所以对启动子区比

20、较测序。 xa13在启动子区（-69 bp -86 bp）范围的突变，包括单碱基的突变，导致了病原PXO99激发xa13基因表达功能的丧失，最终等位基因功能的差异！Zhaohui Chu et al. 2006, Genes & Dev. 20: 1250-1255GS3GN1qSH1xa13Fw2.2亲本选择：选择目标性状差异大并且亲缘关系适中的两个亲本构建群体原因1：目标性状差异大方便准确地判断单株的基因型原因2：亲缘太近，很难在一个很小的区段内找到足够多的分子标记，亲缘太远，发生DNA重组的频率会变小。G. Jander et al. 2002, Plant Physiol:129 44

21、0-4504. 图位克隆中注意的问题材料来源： 1) 种质资源库：谷类作物经过大约10，000年的栽培驯化，有许多的农艺相关形状被选择并保留下来，如增加了的籽粒数目，改变了的籽粒形状，提高了的育性，改变了生长发育特性以适应当地气候，籽粒颜色，落粒性等。它们之间以及栽培型和野生型存在性状的相对差异。因为有些农艺形状相关的基因是由显性向隐性进化的，因此很难用从突变体库中获得回复突变的表型 Saeko Konishi, et al. 2006, Science 312: 1392-1396 2) 人工突变体库:利用物理、化学、转座子法、T-DNA插入法等方法可以获得比自然变异表型更加丰富的突变体。利

22、用物理、化学诱变方法无法获得突变位点，转座子法和T-DNA插入法有时看不到共分离。这些有重要表型却没有共分离的突变体，都可以利用图位克隆分离重要的基因。钱前等. 2006, 植物学通报 23 (1): 1132. 人工突变体库 例如：可以用来克隆自然界存在的有差异的基因，人工诱变的基因（包括复突变基因）通过侧翼序列，在突变体库中找到目标基因被插入的突变体，鉴定目标基因被插入的表型是否改变。利用物理化学诱变产生突变体的优点：不受物种范围的限制，几乎适用于任何物种，突变效率更高：对于某些突变致死基因，因插入突变造成基因功能的完全丧失而不能获得突变株( Lukowitz RJ. 2001, PNAS

23、: 98, 2262-2267) ，理化因素产生的突变改变的往往只是个别氨基酸，突变单株的表型仍然可以在后代中被看到从而可以获得功能下降的突变表型( Conklin PL. et al. 1999, PNAS: 96, 4189-4203)由于物理化学诱变，可能使编码蛋白的氨基酸结构产生的变化，从而改变了蛋白质的性质，产生新的基因 群体大小：初步定位通常利用100-250个单株 例如： 精细定位的估算G. Jander et al. 2002, Plant Physiol:129 440-450 说明：番茄随着基因组测序在一些模式植物中的完成，原来周期长 难度大的图位克隆，因为物理图谱和分子标记的存在而成为基因克隆的可取的方法精细群体大小： 理论上，精细定位群体越大，在目标基因两侧都得到一个重组单株的可能性越大，但是群体过大，浪费物力和人力，因此确定一个适当的群体大小非常重要。精细定位群体大小的估算： 假设重组率为一个恒定的量，T 表示目标基因区段两侧两个紧密连锁的标记之间的物理距离 ，单位为Kb ，R表示物理距离与遗传距离的比率，单位为Kb/cM，N为配子的数目（测交数目或者两倍的F2代单株 ） 在异染色质区或者目标区段内有染色体倒置R值会变大 全基因组的R值是不同的 特定区段的R值已知 仍然可以